存在于肿瘤微环境中的免疫细胞分属于固有和适应性两个免疫系统，并且在几乎所有人类实体肿瘤中存在，他们以从微浸润到明显炎症的多种密度形式存在。由于淋巴细胞通畅是免疫浸润部位的最大组分，所以他们通常被称为“肿瘤浸润性淋巴细胞”或TIL。TIL的表型和功能特征，其与肿瘤细胞或肿瘤间质的相互作用，及他们在预后和预测中的意义，都已成为全球研究的热点。
TILs在肿瘤微环境的作用
首先CD8+T细胞（细胞*性T细胞）被认为是主要的抗肿瘤免疫效应性细胞，CD8+T细胞表面的MHCI可专一辨识肿瘤相关抗原，与肿瘤细胞结合后产生穿孔素与其他细胞*素，杀死癌细胞但不影响正常细胞。CD4+T细胞（辅助性T细胞）的一个亚群对于为CTL增值和功能提供细胞因子介导的促进作用至关重要。NK细胞不是MHC限制性的且不需要抗原事先致敏，可通过释放穿孔素、颗粒酶和细胞因子识别并消除肿瘤细胞。B细胞在被抗原特异性激活后可形成产生抗体的浆细胞，从而介导体液抗肿瘤免疫。这些细胞的协同作用对抗肿瘤反应的发生至关重要。
CD8+T细胞
CD8+T细胞为公认的主要抗肿瘤免疫效应性细胞。CD8+T细胞表面的MHCI可专一辨识肿瘤相关抗原，与肿瘤细胞结合后产生穿孔素与其他细胞*素，杀死癌细胞但不影响正常细胞。但由临床观察到，在肿瘤微环境中可辩识肿瘤原位或外周血中的抗原表位的CD8+T细胞常常被消灭。已证明这些CD8+T细胞膜上被结合了肿瘤细胞分泌的FasL或PDL-1或TGF-β，而促使TIL中抗肿瘤效应性的CD8+T细胞凋亡；抑或肿瘤抗原丢失、MHCI分子下调、进而使肿瘤逃逸宿主免疫系统。这影响了所有T细胞响应防止过度活化和组织损伤。另外肿瘤微环境中的抑制性细胞（调节性T细胞Treg和髓系抑制细胞MDSC）通过产生抑制性细胞因子抵消了CD8+T细胞的抗肿瘤效应。
CD4+辅助性T细胞
CD4+T细胞存在于实体肿瘤的频率高于CD8+T细胞，包括Th1、Th2、Th17与调节性T细胞(Treg)几个亚型。Th1分泌IL-2和IFN-γ，起到活化与促进CD8+T细胞与NK细胞增殖。Th1亦影响树突状细胞(DC)的抗原呈递功能。相反，Th2会促使B细胞成熟，克隆增殖和类别转换，因而增进体液免疫应答。此“Th1/Th2”平衡模式与比值经常在癌症和其他疾病发生改变，癌症患者的血液和肿瘤组织中的Th2细胞数量往往多过Th1细胞。因此，Th1/Th2比例也常用于预测有无转移生存率，并提示在肿瘤微环境发生的免疫应答唯一重要的预后因素。Th17究竟是促肿瘤还是抗肿瘤仍需研究。
调节性T细胞
调节性T细胞(Treg)仅占CD4+辅助性T细胞亚群中的~5%，但对于调节原位免疫反应发挥重要作用。在不同肿瘤中可发现，肿瘤细胞可将Treg招集到肿瘤微环境中，因此Treg的存在与功能似乎与癌症的预后成反比。人源Treg缺乏明确的表型分类，自然Treg细胞(naturalTreg，nTreg)(CD4+CD25highFOXP3+)可控制癌症相关的炎症发生；诱导Treg细胞(inducedTreg,iTreg)似乎下调原位肿瘤反应，促进癌细胞生长。由于Treg是异质的，它们作为预后生物标志物的应用范围受到限制，须谨慎使用。
B细胞
B细胞起源于骨髓，后迁移至淋巴器官，在被抗原激活后产生抗原特异性抗体的浆细胞，从而介导体液抗肿瘤免疫。在人类实体瘤中的TILs细胞群中亦含有不等比例的浸润性B细胞。虽然临床研究中多倾向于观察T细胞应答，但浸润性B细胞的作用也愈来愈受重视。无论是对乳腺癌，非小细胞肺癌（NSCLC）和直肠癌（CRC）化疗均有反应，被证实为可做预后生物标志物。
NK细胞
NK细胞介导固有免疫反应且能在不需要事先致敏的情况下直接介导细胞*作用。NK细胞可识别消除肿瘤细胞，释放穿孔素、颗粒酶和细胞因子，亦是强效的INF-γ产生细胞。然而临床结果显示，肿瘤微环境中NK细胞几乎与实体肿瘤没有正向关联，即使NK细胞的抗体依赖性细胞*性(ADCC)可起抗肿瘤活性；似乎暗示着NK细胞的功能在癌症中被下调，此种损坏预示着肿瘤的进展和不良预后。
肿瘤中数量最多的细胞是肿瘤细胞，免疫细胞的比例只能占到其中很小的一部分，因此如何高效率的分离肿瘤浸润的免疫细胞成了实验的关键，所幸，目前我们已经试验过了一套可以高得率提取肿瘤浸润免疫细胞的protocol，实验操作分为肿瘤分离、制备肿瘤细胞悬液，percoll分离免疫浸润淋巴细胞，细胞染色，上机分析这五个部分。
肿瘤分离1.采用颈椎脱臼法将荷瘤小鼠处死，放置于含有75%酒精的烧杯中，浸泡30s。2.左手持镊子，右手持弯剪，沿肿瘤边缘剪下长约1cm的口子，可清晰看见肿瘤附着于皮下，沿着肿瘤边缘轻轻剪开连接处，剥离肿瘤。3.将剥离的肿瘤放入mm的培养皿中，并在室温下加入5-10ml的HBSS。注：肿瘤体积一般不超过0mm3，肿瘤质量在0.6-0.8g之间。制备肿瘤细胞悬液4.待所有肿瘤剥离完毕后，将肿瘤转移至1.5mlEP管中，手持弯剪将肿瘤剪碎。
5.将肿瘤组织悬液转移到50ml离心管中，用适量HBSS冲洗EP管，并将悬浮液转移到离心管中。管中的总体积为45ml。
6.在管中加入5ml10×TripleEnzymeMix，在摇床上以80rpm、37℃的条件消化1-3小时。
7.消化完毕后，50g，10min离心，收集上清，则为肿瘤细胞悬液。
注：剪刀剪碎肿瘤的标准为，其可被1ml的枪头自由吸取，无阻碍。
10×TripleEnzymestocksolution(ml)在80mlHBSS中混合1gCollagenaseIV,mgHyaluronidase和20,UnitsDNaseIV，添加HBSS至ml。使用0.22μm的滤器进行过滤，分装成5ml储存在-20℃，使用前恢复至室温。
Percoll分离免疫浸润淋巴细胞
8.×g，5min离心上清，加入10mlHBSS重悬，将其转移至15ml离心管中，g，5min再次离心，用40%percoll重悬细胞。
9.在新的15ml离心管中提前加入4ml80%percoll，再用巴氏滴管小心的沿壁将4ml含肿瘤细胞的40%percoll沿壁加在80%percoll的上面。
10.g，30min离心（升速=1，降速=0），40%percoll与80%percoll交界处则为免疫细胞。
Fig2.不同浓度的percoll分离免疫细胞细胞染色11.收集细胞，加入10mlPBSg，5min离心。
12.μlPBS重悬，转移到1.5mlEP管中，进行封闭。
13.使用相应的抗体，与细胞一起共孵育。
上机分析细胞分析的marker表达：
巨噬细胞：CD45，CD11b，F4/80，CD(M2)，CD86(M1)
MDSC：CD45，CD11b，Ly-6G，Ly-6C
T细胞：CD45，CD3，CD8，CD4
Th1/2/17/Treg细胞:CD3，CD4，IFN-γ(Th1)，IL-4(Th2)，IL-17A(Th17)，CD4CD25Foxp3(Treg)Fig3.流式圈门策略从流式方案设计到实验实施、数据分析，伯锐科技竭尽全力为您提供全方位服务，解决您的后顾之忧！
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