1.文章涉及的肿瘤类型、样本类型，实验方案评估参数
2.新鲜肿瘤样品解离方案（方案解读以及优化过程）
3.冻存肿瘤样品抽核方案（不同类型肿瘤使用不同抽核方案对比）
4.抽核与解离方案得到数据的最大差异
5.如何选择适合的解离方案
肿瘤细胞组成复杂包括多种恶性和非恶性细胞，这些细胞的多样性以及细胞间的相互作用影响肿瘤的发生发展和耐药性。通过单细胞转录组技术可以描绘肿瘤环境中的细胞类型、状态、遗传多样性和细胞间相互作用。
单细胞RNA-seq(scRNA-seq)和单细胞核RNA-seq（snRNA-seq）是肿瘤组织进行单细胞测序的两种主要方法。其中scRNA-seq需要根据不同的肿瘤类型制定相应的解离方法，其中的酶消化过程可能会丢失高度敏感细胞或引起基因表达的变化。另外scRNA-seq对时间要求较高，获得新鲜的组织后需要尽快完成解离的操作，这对于临床样本来说是一个挑战。而snRNA-seq则对时间敏感性较低，可以从冷冻样本中分离出单个细胞核进行分析。并且某些因为大小或者细胞敏感即使在新鲜情况下也不能成功的样本可以通过snRNA-seq来处理。只是相对于酶解法来说，细胞核中mRNA含量较低。
由于不同肿瘤的细胞成分和细胞外基质(Ecm)不同，scrna-seq和snrna-seq在应用于不同类型的肿瘤时都有一定的局限性。为了应对这些实验挑战，本文作者分别使用scRNA-Seq和snRNA-Seq开发了一个用于新鲜和冷冻肿瘤处理的系统工具箱(图1)。该工具箱包含了作者的实验工作流程和方法、计算方法和评估指标。为了使肿瘤和样本类型更有说服力，作者一共测试了8种不同组织和样本特征的肿瘤(图2)，包括对来自同一肿瘤样本相对应的新鲜和冷冻标本进行比较。作者的这些工作为多种肿瘤类型提供了直接推荐方案，决策树方便研究人员为他们的研究目标选择最合适的方案。另外本文作者还制定了如何为新的肿瘤和样本类型定制方案的指南。
正文肿瘤组织
非小细胞肺癌（NSCLC）、转移性乳腺癌（MBC）、卵巢癌、神经母细胞瘤（NB）、胶质母细胞瘤（GBM）、儿童高级别胶质瘤、慢性淋巴细胞白血病（CLL）、儿童肉瘤和黑色素瘤。
样本类型
手术切除、活检、腹水，患者来源的原位异种移植（O-PDX）
实验方案评估参数
1.细胞/核质量
实验层面：测量了细胞存活率(对于scRNA-Seq)，细胞/细胞核悬浮液中的二倍体或聚集体的程度，以及整个转录组扩增后恢复的cDNA质量。
数据分析：评估了比对到转录组、基因组和基因间隔区的读取百分比，超过最少基因和独特转录本(由唯一分子标识符UMI反映)的细胞/核的数量，每个细胞/细胞核检测到的读取、转录本(UMI)和基因的数量，以及来自线粒体基因的UMI百分比。为了比较不同方法，当样本之间的测序饱和度或总读数存在显著差异时将样本中的读数降低到相等数量然后重新估计和比较它们的QC指标
2.恢复的细胞/核的数量与预期的细胞/核的数量
评估了可能为空的液滴的比例(即只包含环境RNA，而不是来自被包裹的细胞的RNA)，以及双细胞的比例。因为空滴评分的算法是为细胞开发的，所以没有用它来评估snRNA-Seq。
3.细胞组成
作者考虑了捕获细胞类型的多样性，从每个子集中恢复的细胞/核的比例，以及在恶性细胞中恢复的拷贝数畸变(CNA)模式类别。根据CNA的存在(当可检测到时)和它们最相似的细胞类型特征来注释恶性细胞。作者认为如果一个方案能恢复更多不同的细胞类型，这是一种优点，因为这有利于进行全面的研究。然而，捕获不同类型的细胞可能并不总是研究人员想要的目标，也不总是肿瘤成分的最准确表现。具体需要根据自己的实验需求来做抉择。
图1：sc/sn-RNAseq实验分析流程
DE：差异基因
ST：SaltandTris
InferCNV：infercopynumbervariation
图2：不同类型肿瘤测试后最佳protocol列表
白色圆圈：新鲜组织，解离
蓝色圆圈：冷冻样本，抽核
C4：胶原酶4，DNase1
PDEC：琏霉蛋白酶，弹性蛋白酶，胶原酶A，胶原酶4，DNase1，淀粉酶
LE：弹性蛋白酶，DNase1
NST：NonidetP40，salts，Tris
CST：CHAPS，salts，Tris
TST：Tween，salts，Tris
LD：LiberaseTM，DNaseI
BTD：脑肿瘤解离
MHTD：美天旎肿瘤解离试剂盒
1.新鲜肿瘤样本解离的实验流程新鲜解离的肿瘤类型：非小细胞肺癌（NSCLC）、卵巢癌、转移性乳腺癌（MBC）、神经母细胞瘤（NB）、胶质母细胞瘤（GBM）、慢性淋巴细胞白血病（CLL）（冷冻保存）。
本文作者根据每种肿瘤类型的特征，如细胞类型组成和细胞外基质成分，选择不同的酶混合物来处理新鲜组织。例如，分解乳腺癌中的胶原纤维，使用LiberaseTM；分解胶质母细胞瘤中的胞外基质，则使用木瓜蛋白酶(半胱氨酸蛋白酶)。另外酶混合液中还加入了DNaseI来消化从死亡细胞中释放的DNA，以降低单细胞解离悬液的粘度。
本文构建的工作流程（图3）最大限度缩短从临床环境中从患者身上取出样本到将其解离成细胞之间的时间间隔，从而最大限度地提高细胞活性，细胞类型多样性和RNA图谱的保存率。确定了不同类型肿瘤分离条件，并构建了具体的步骤作为决策树，以适应临床样本之间的差异。
1.1解离实验步骤
图3：新鲜肿瘤组织解离实验流程
解离步骤
样品从介入超声科（穿刺样本）和手术室（切除样本）拿到后分别放入到不同的培养基汇总。MBC-DMEM；NSCLC-RPMI；卵巢癌症，GBM-含有HEPE缓冲液的RPMI
1.样本送到实验时候，首先用预冷的pbs洗去样品表面的杂质，再将样品放入含不同酶解液的EP管中（穿刺样品-2mLEP管；手术样本-5mLEP管）。
2.使用锋利的剪刀在EP管中将样本剪碎至0.4mm一下的碎片。
3.37°C，14RPM孵育10分钟，孵育结束后用1mL移液枪吹打20次。继续孵育10分钟，再次用1mL移液枪吹打20次。
4.4°C，g-g离心4-7分钟。
5.去上清，沉淀用uL-uLACK缓冲液重悬，冰上孵育1分钟。每，个细胞添加月uLACK缓冲液，至少uL。
6.加入2倍ACK缓冲液体积的PBS（预冷），4°C快速离心8秒使细胞沉淀（离心力不能超过10g）。
7.去上清。评估沉淀颜色，如果RBC仍然存在（颜色为粉红色或红色），则重复步骤6两次。
如需去除MBC中的细胞团块，将沉淀物重新悬浮在μlTrypLE（LifeTechnologies，目录号）中，在室温下用μl移液枪吹打1分钟后加入μlRPMI（10%FBS）灭活TrypLE。快速离心沉淀细胞。
8.沉淀使用50μlPBS（0.4%BSA）重悬。
9.细胞计数，细胞活性检测合格后上机。
1.2解离方案优化
细胞类型特异性和细胞组成是protocol优化的重要参数，优化过程以NSCLC手术切除样本为例，文中使用了三种处理方案。
(1)胶原酶4、DNaseI(NSCLC-C4)
(2)链霉蛋白酶、淀粉酶、弹性蛋白酶和胶原酶A和4的混合物、DNaseI(PDEC)
(3)LiberaseTM、弹性蛋白酶、DNaseI(LE)
恢复细胞多样性和只包含环境RNA的液滴(“空滴”)比例是优先评估的两个标准。在NSCLC14切除样本中所有方案都得到了高质量的恶性增殖细胞表达谱，二倍体和CNA模式相似数量的细胞。然而，只有PDEC和LE两个方案捕获到了成纤维细胞和内皮细胞（图4，5）。
图4：不同解离方案下NSCLC样本的QC对比
图5：不同解离方案下NSCLC细胞表达谱（左），细胞组成类型（中），CNV模式（右）
图6：不同解离方案下NSCLC样本中空滴和双滴的分布和比例
NSCLC-C4中“空”液滴比例增加了倍(PDEC和LE分别为7%和0.04%)。NSCLC-C4方案中聚集在巨噬细胞内的中被标记为“空”液滴的比例较高(图6)，这表明这些细胞条形码要么具有较低的测序饱和度，要么表明样本本身具有较高的环境RNA含量。
由于细胞类型恢复和不同方案之间的测序深度不同，跨方案/样本的QC指标有一定的挑战性，作者还在NSCLC14样本中分析评估每种细胞类型内的QC指标，并通过不同方案的总读数进行下采样(图5图7)。
图7：不同解离方案下NSCLC样本中reads，genes，UMI，mito.gene数量
例如，当考虑非小细胞肺癌14样本中的所有细胞时，非小细胞肺癌-C4的检测基因数显著高于PDEC，但在B细胞中，PDEC的检测基因数显著高于非小细胞肺癌-C4，而在上皮细胞中，LE的检测基因数最高。由于检测到的基因(和其他指标)的数量在不同的细胞类型之间不同，并且细胞类型的组成在不同的方案间也不同，因此在选择方案时评估特定细胞类型的QC是很重要的。此外，较低的测序饱和度并不直接反映非小细胞肺癌-C4方案的性能，而且通过总读数进行下采样并没有定性地改变我们的任何方案评估指标（图8）。考虑到所有这些特点，作者选择了PDEC方案来处理非小细胞肺癌肿瘤样本，因为它在细胞类型多样性和每种细胞类型的质量控制中平衡最好。
图8：下行采样后不同解离方案中NSCLC样本QC对比
1.3快速耗尽免疫细胞以富集恶性和间质细胞
由于某些肿瘤标本中恶性细胞比例相对较低，免疫细胞比例特别高。通过去除CD45+免疫细胞既可以富集无特异性标志物的上皮细胞，又可以维持基质细胞比例。本文选择使用带有抗CD45抗体的MACS微珠，而不是用流式细胞仪(FACS)进行分选，因为流式仪器并不能随时能用而且需要更长的样本处理时间，这可能会对细胞造成额外的压力。本文通过测试不同的商业试剂盒并评估一轮和两轮耗竭的影响来优化CD45+细胞耗竭策略。例如，用scRNA-Seq分析非小细胞肺癌肿瘤样本(非小细胞肺癌17)在耗竭前后的情况后发现耗竭后上皮细胞从26%增加到82%，并且没有免疫细胞被检测到。同样，在卵巢腹水样本(HTAPP-)中，恢复了32%的上皮细胞(图9)。
图9：在非小细胞肺癌和卵巢癌腹水样本中CD45细胞去除后免疫细胞被富集
1.4scRNA-Seq解离工具箱应用于不同肿瘤活检和治疗后样本
scRNA-Seq工具箱成功应用于来自不同解剖部位的临床活检样本。例如，在MBC中使用LD方案解离两名患者淋巴结转移切除样本(HTAPP-)和活检(HTAPP-)，得到相似的成功的QC结果。两名患者切除和活检的样本有不同的细胞成分：与切除相比，活检的上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞的比例较高，而T细胞的比例较低。工具箱中提供的方案还成功分析了MBC肝转移瘤(HTAPP-和HTAPP-)的活检组织，除了恢复与淋巴结活检中相似的一系列细胞类型外，还恢复了一些肝细胞。因此，该方案可用于不同解剖转移部位的乳腺癌转移。ScRNA-Seq工具箱在处理后获得的样本上也表现良好，即使细胞死亡和处理后细胞类型组成的变化会带来挑战。
例如，来自同一神经母细胞瘤患者的治疗前诊断活检(HTAPP--Pre)和治疗后切除(HTAPP--Post)都产生了高质量的QC和类似的恶性细胞CNA模式。治疗前活检(个细胞：神经内分泌、T细胞和巨噬细胞)比治疗后切除(个细胞：神经内分泌、T细胞、巨噬细胞以及内皮细胞和成纤维细胞)恢复的细胞更多，但细胞类型更少，这与治疗后观察到的纤维化是一致的。在神经母细胞瘤O-PDX样本中测试了另一种分离方案(木瓜蛋白酶)，结果得到了高质量的恶性细胞图谱。木瓜蛋白酶方案的实验质量控制优于在使用NB-C4的其他样本中观察到的。因此，作者最终选择了木瓜蛋白酶方案解离神经母细胞瘤。
除了非小细胞肺癌、卵巢癌腹水、MBC和神经母细胞瘤样本外，作者还建立了适用于GBM(GBM)、CLL(CLL1)和卵巢癌肿瘤(HTAPP-)的有效scRNA-Seq方案。特别是在CLL中，成功地从含有活细胞的冷冻保存样本中恢复了预期的细胞类型。这说明与其他类型的细胞相比，免疫细胞对冷冻的抵抗力增强了，但冷冻保存会增加受损细胞的比例，不一定能恢复肿瘤中所有的恶性和其他非恶性细胞。
图10：不同肿瘤类型样本的解离方案对比
2.用于冷冻肿瘤snRNA-Seq分析的四种抽核方案对于实体肿瘤的冰冻标本，本文优化评估了七种肿瘤类型不同核分离方法(图11)：神经母细胞瘤、单核细胞瘤、卵巢癌、儿童肉瘤、黑色素瘤、儿童高级别胶质瘤和CLL。用于抽核的方案主要有四种：1.EZPrep；2.NST：NonidetP40、salt、Tris；3.CST：CHAPS，salt、Tris；4.TST：Tween、salt、Tris。这些方法主要在机械力、缓冲液成分，洗涤液成分上有所不同。
2.1抽核实验步骤
图11：冷冻肿瘤样本抽核解离步骤
*全程在冰上操作*
1.将一小块冷冻的肿瘤组织放入含有1mLCST、TST或NST缓冲液的6孔板中。
2.对于在OCT中冷冻的样品，在10cm培养皿中仔细去除OCT并用PBS清洗样本中残余的OCT。
3.使用NoyesSpringScissors在冰上切割组织10分钟。如果是冷冻细胞样品则是转移到冰浴的缓冲液中。
4.过40μm细胞筛后再用1mL缓冲液冲洗滤膜。加入3mL1×ST缓冲液将过滤后悬液体积调至5ml。
5.将样品转移到15ml锥形管中，4°C，g，离心5分钟。
6.去上清，沉淀用1×ST缓冲液重悬。重悬体积取决于沉淀的大小，通常体积为–μl。
7.将细胞核溶液过35μm细胞筛后细胞计数。
8.质检合格后上机测序。
2.2抽核方案优化
QC评判标准中作者排除了空滴这一选项，因为这适用于scRNA-seq。在snRNA-Seq数据分析中本文将reads比对到外显子和内含子，并调整了转录的QC阈值(UMI)和基因计数，以反映细胞核中较低的预期mRNA含量。在实验上，增加了光学显微镜检测的步骤，以确保完全分离细胞核，并估计二重体、聚集体和碎片。与scRNA-Seq一样，这些方案同样进行了多次测试，以确认重复性。
总体而言，EZPrep的表现通常逊于CST、NST和TST，三种核分离方法TST、CST和NST得到的细胞核质量具有类似的性能。TST通常能得到最大的细胞类型多样性和每种细胞类型的细胞核数量，以及最高的线粒体基因表达，而NST通常得到的单个核基因量以及细胞类型多样性最低（图12）。
图12：四种不同抽核方式处理神经母细胞瘤后的QC对比
在神经母细胞瘤中，在手术切除样本HTAPP-分别测试了四种抽核方案，都产生了差不多数量的高质量细胞核(EZ、CST、NST和TST分别为、6,、7,和7,)、核二联体、细胞核类型。与三种ST方案相比，用EZ方案制备的细胞核UMI和检测到的基因数量都相对较少。TST比其他方案得到更多的内皮细胞、成纤维细胞、神经嵴细胞和T细胞。TST也产生了更高的线粒体基因表达量，不仅在神经母细胞瘤中有这种现象，在其它肿瘤中同样出现了，因为当使用这种方法时，核膜、内质网和核糖体仍然附着在细胞核上（图13）。
图13：不同类型肿瘤使用不同抽核方式后的QC对比
CST、NST和TST的核分离方法在检测MBC、卵巢癌和儿童高级别胶质瘤样本时结果相似，其中TST细胞类型多样性最高，特别是在非恶性细胞。采用CST和NST方案分别处理转移性脑组织样本HTAPP-，HTAPP-，转移性肝活检样本(HTAPP-)。在所有方案中，QC统计数据和CNA模式都是相似的，捕获到的上皮细胞核最多。CST和NST捕获的细胞类型分布相似，而TST捕获到了更多的非恶性细胞，包括T细胞，以及更高比例的线粒体基因比例。
图14：不同肿瘤样本不同抽核方案下比对到的CAN表达模式
在卵巢癌中，CST、NST和TST在同一样本中得到了相似的CNA模式(HTAPP-)，TST捕获了最多类型的细胞，而NST恢复的细胞核较少，每个核的基因和每个核的UMI较少，并且细胞类型多样性较低（图14）。
总体而言，对于大多数肿瘤类型，本文最终选择了TST方案，而对于来自神经组织的肿瘤，如儿童高级别胶质瘤，选择了CST方案。
2.3.scRNA-Seq和snRNA-Seq得到的细胞组成不同
本文通过在神经母细胞瘤（HTAPP-）、MBC（HTAPP-）、CLL（CLL1）和O-PDX（O-PDX1）中测试来自同一样本的配对样本来比较scRNA-Seq和snRNA-Seq。这两种方法通常恢复相似的细胞类型，但有时比例不同。在神经母细胞瘤和MBC中，免疫细胞在scRNA中更为普遍，而实质（尤其是恶性）细胞在snRNA中更为普遍。在所有测试的肿瘤类型中，通过典型相关分析进行批量校正后，细胞和细胞核，并按细胞类型分组（图15）。
图15：抽核与解离捕获恢复的细胞种类组成对比
最后，利用匹配的数据来检查分离的新鲜组织细胞和速冻组织细胞核中的表达模式进行比较以鉴定新鲜组织细胞在解离过程中引入的压力。本文根据之前文献中发表的“解离特征”数据对每个细胞或细胞核进行了评分。总的来说，分离信号在细胞中的检出率高于细胞核，尤其是在实体瘤（神经母细胞瘤和MBC）中，在细胞中的检出率显著高于细胞核（图16）。
图16：同一类型的肿瘤样本分别解离抽核后数据对比
3.如何为肿瘤样本选择适合的处理方案在选择新鲜组织解离方案时，建议测试两到三种解离方法，根据肿瘤类型和组织组成进行选择，并根据新鲜样本决策树进行处理。在为冷冻组织选择方案时，文章建议测试NST、TST和CST三种方案，并根据snRNA-Seq工作流程进行处理。虽然文章最终为测试的八种肿瘤类型选择了最佳方案，但由于样本特性和研究问题不同，实际最佳方案也会有所改变。
首先，每个患者和每个样本都是不同的，理想的方案取决于研究目标。例如，有的研究可能想要检测尽可能多的细胞类型，并倾向于稀有细胞的类型，而另一些研究人员可能对特定类别的细胞感兴趣，还有一些研究人员希望比较不同肿瘤中的细胞比例，并尽可能的还原真实情况。
选择scRNA-Seq还是snRNA-Seq通常由样本类型、要解决的生物学问题以及物流运输等多因素决定。scRNA-Seq测量整个细胞的表达谱；snRNASeq将样本采集与处理过程分开，并可以从难以分离的样本（例如，骨骼、脂肪和肝脏）中回收细胞核，还能使用冷冻保存的样本。
本文中绘制的工具箱将帮助研究人员系统地分析更多的人类肿瘤，从而加深对肿瘤生物学的理解。工具箱支持绘制高分辨率肿瘤细胞图谱，为临床工作提供信息，有助于提高诊断和治疗的精确度！
参考文献
SlyperM,PorterCBM,AshenbergO,etal.Asingle-cellandsingle-nucleusRNA-Seqtoolboxforfreshandfrozenhumantumors[publishedcorrectionappearsinNatMed.Jun25;:].NatMed.;26(5):-.doi:10./s91---1
相关阅读植物单细胞原生质体难制备怎么办？植物抽核帮你忙
单细胞专题
PNAS:单细胞测序揭示哮喘模型下肺的免疫景观
单细胞专题
浅谈组织离体时长对单细胞转录组测序的影响
单细胞专题
Science揭示了肾脏肿瘤的细胞特征（附细胞marker基因列表）
单细胞专题
文献解读：利用单细胞RNA-seq揭示胰腺导管腺癌恶化过程中肿瘤微环境的动态变化
单细胞专题
点击下方图片进入云平台资料汇总：所见即所得，绘图高规格联川云平台，让科研更自由预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇