既往研究发现结直肠癌肿瘤微环境呈葡萄糖限制性，而肿瘤浸润性Treg细胞较Teff细胞对低糖及高乳酸的环境适应性更强，其内在机制长期难以解决。MondoA-TXNIP轴调控多种组织细胞的糖酵解。其中，MondoA是一种转录因子，感受细胞内葡萄糖的水平，在Treg细胞中高表达。Thioredoxin-InteractingProtein(TXNIP)是MondoA的靶基因，编码的蛋白调控葡萄糖代谢及氧化还原。那么MondoA-TXNIP轴是否在Treg细胞中发挥作用？其对糖酵解的调控是否能解释肿瘤浸润性Treg细胞对低糖的适应性？来自上海交通大学XuemeiTong课题组年4月发表在Gastroenterology(IF:22.)的文章首次解决了这一问题。本文的一大亮点是首次将MondoA-TXNIP轴与肿瘤浸润性Treg细胞的糖代谢联系起来，在结直肠癌临床样本、细胞、动物模型中阐释了肿瘤微环境对Treg细胞的代谢特征及功能。
一、背景介绍结直肠癌可自发自发产生或由炎症性肠病转化而来，Th17细胞分泌的IL17A介导了肠道炎症，从而促进了结直肠癌的发生发展。目前的抗癌免疫疗法主要通过促进IFN-γ+CD4+T细胞、CD8+T细胞以及NK细胞的功能以加强抗肿瘤免疫。
调节性T细胞（Treg）抑制过度的效应T细胞反应并维持免疫稳态。通常，肿瘤内高浸润Treg细胞与不良预后相关。而结直肠癌中，高肿瘤浸润性Treg细胞意味着较好的预后，这可能是因为Treg抑制炎症从而减少了炎症相关结直肠癌的发生。
结直肠癌的肿瘤微环境通常是葡萄糖限制性的，这可能是由于肿瘤细胞与免疫细胞竞争葡萄糖。相较于效应T细胞，Treg细胞对低糖和高乳酸具有更强的适应性。肿瘤浸润性Treg细胞被重编程为高葡萄糖消耗，并促进了效应T细胞衰老。此外，葡萄糖代谢促进了Treg细胞的迁移并抑制了其免疫抑制功能。
MondoA是Mondo家族转录因子的一员，在多种组织细胞中作为关键的葡萄糖感受分子。在骨骼肌细胞和胰腺β细胞中，MondoA抑制糖酵解。Thioredoxin-InteractingProtein(TXNIP)是MondoA的靶基因，编码的蛋白调控葡萄糖代谢及氧化还原。尽管MondoA-TXNIP轴已在多种组织细胞中被证实，然而生理条件下其对免疫细胞的代谢调控尚未待探索。
文章机制图
文章思路图
二、结果解析1、结直肠癌中，肿瘤浸润性Treg细胞抑制MondoA-TXNIP轴并增强糖酵解
从之前的一项结直肠癌的研究中，作者下载了外周血与肿瘤组织中Treg的scRNA-seq数据并分析得到差异表达基因，GO、KEGG、GSEA分析发现差异基因主要与糖酵解相关。接着作者从结直肠癌病人的外周血和肿瘤组织中提取Treg细胞进行2-NBDG葡萄糖摄取试验，结果示肿瘤浸润性Treg细胞葡萄糖摄取能力增强。此外scRNA-seq还示TXNIP在肿瘤浸润性Treg中下调，随后的流式细胞证实了这一点。鉴于Mondo家族有多个成员MondoA/MondoB，作者试图探索哪一个在Treg中调控TXNIP，PCR示MondoB的mRNA几乎不表达，而MondoA的mRNA表达量较高，即Treg中MondoA调控TXNIP，随后的WB也证实了这一点。随后，作者试图探索环境中葡萄糖水平是否会影响MondoA对TXNIP的转录，ChIP示低糖可抑制MondoA对TXNIP的转录。
综上，肿瘤浸润性Treg可能通过MondoA-TXNIP轴来感受结直肠癌肿瘤微环境中的低氧状态。
图1
2、MondoA的敲除增强了Treg的糖酵解
作者构建了Treg特异性敲除MondoA的小鼠，与正常小鼠形成KO组与WT组的对照。提取两组小鼠Treg，PCR示KO组MondoA表达显著减少，即MondoA敲除废止了Treg中TXNIP的表达。此外，RNA-seq示KO组较WT组糖酵解相关基因高表达，并得到了PCR的验证。KO组较WT组，葡萄糖摄取及乳酸生成均增多，ECAR（细胞外酸化率，反映糖酵解活性）示糖酵解率及糖酵解能力均增强。
综上，MondoA的敲除可增强Treg的葡萄糖摄取，抑制了TXNIP的表达从而增强糖酵解。
图2
3、MondoA的敲除削弱了Treg的免疫抑制功能
作者试图探索MondoA与Treg的表型即其免疫抑制功能的关系。故从WT组与KO组提取Treg细胞进行体外抑制实验，发现无论Treg：Teff是1:1,1:2,1:4还是1:8，KO组Teff的增殖活性均更强，即MondoA敲除抑制了Treg的免疫抑制功能。随后作者进行体内实验，作者将结直肠癌细胞MC38皮下种植到两组小鼠，发现KO组的肿瘤生长较WT组小，印证了体外实验中，KO组Treg削弱的免疫抑制功能。取肿瘤组织与脾脏及引流淋巴结一起进行流式检测，发现KO组IFN-γ+CD4+T细胞和IFN-γ+CD8+T细胞均较WT组增多，提示抗肿瘤免疫的增强。然而，两组间IL-17A+CD4+T细胞无差异。
综上，MondoA的敲除可抑制Treg的免疫抑制表型，且增强了效应T细胞的抗肿瘤作用。
图3
4、MondoA-TXNIP轴可能通过糖酵解调控Treg细胞的功能
作者提取WT组与KO组小鼠的Treg细胞后，进一步对KO组Treg进行逆转录病*TXNIP转染以过表达TXNIP，重新得到WT,KO,KO-TXNIP三组小鼠。PCR示MondoA敲除可抑制TXNIP的表达，促进糖酵解相关基因的表达，而过表达TXNIP可逆转这一效应。葡萄糖摄取实验示，MondoA敲除可增强葡萄糖的摄取，而过表达TXNIP可逆转这一效应。ECAR示，MondoA敲除可抑制Treg细胞的糖酵解速率和糖酵解能力，而过表达TXNIP可逆转这一效应。高糖与低糖环境下的体外抑制实验示，高糖环境下MondoA敲除可抑制Treg的免疫抑制功能，而低糖环境下则无影响。
综上，MondoA感受Treg细胞周围环境中的葡萄糖量，并通过MondoA-TXNIP轴调控糖酵解，从而影响Treg细胞的免疫抑制功能。
图4
5、Treg中MondoA的敲除促进了AOM-DSS诱导的结直肠癌的发生
AOM-DSS可诱导小鼠肠道炎症，并进一步诱导结直肠癌的发生。作者试图探索Treg细胞在炎症相关结直肠癌的作用。生存分析示，KO组生存期显著短于WT组。内镜及病理示，KO组肿瘤数量更多且体积更大。组织学染色示，KO组肠道增生及腺瘤生成增多。即MondoA的敲除促进了结直肠癌的发生发展。肿瘤及结肠固有层的流式细胞示，KO组较WT组Treg细胞减少，抗炎因子IL-10表达减少，免疫抑制分子CTLA-4和CD39表达减少。即MondoA的敲除抑制了肿瘤微环境的抗炎与免疫抑制作用。
综上，炎症相关结直肠癌中，MondoA敲除的Treg细胞数量减少且免疫抑制功能减弱，但却促进了结直肠癌的发生。
图5
6、肿瘤浸润性Treg中MondoA的敲除诱导了富含IL-17A的结直肠癌肿瘤微环境
取小鼠脾脏，外周淋巴结及结肠癌组织进行流式细胞分析示，KO组结肠癌组织中IL-17A+Treg细胞增多，而IFN-γ+Treg不变，即Treg呈Th17样表型。此外，KO组结肠癌组织中IL-17A+T细胞也增多，提示MondoA的敲除既可增强Treg的Th17样表型，也可以增强其他T细胞的IL-17A分泌，即MondoA的敲除促进了肿瘤微环境中IL-17的富集。病人临床样本的癌与癌旁组织流式细胞分析示，癌组织较癌旁组织低表达MondoA，而高浸润IL-17A+Treg细胞和IL-17A+T细胞，与小鼠实验结果一致。
综上，MondoA的敲除不仅促进了肿瘤浸润性Treg表达IL-17A，还促进了非Treg细胞分泌IL-17A，形成了IL-17A富集的结直肠癌肿瘤微环境。
图6
7、IL-17A阻断剂可与PD-1抑制剂协同治疗AOM-DSS诱导的结直肠癌
小鼠结直肠癌模型诱导天后，将小鼠分为对照组，抗IL-17A治疗组和抗PD-1联合抗IL-17A治疗组，分别给药15天后进行评价。病理示，MondoA敲除促进了肿瘤的生成，而抗IL-17A治疗均可减小肿瘤数量及体积，并废止WT与KO组间差异，抗PD-1联合IL-17A治疗可进一步减小肿瘤数量及体积。此外，流式细胞示，抗IL-17A或抗PD-1联合IL-17A治疗均减少了耗竭性CD8+T细胞（PD-1+CD8+T），增加了*性CD8+T细胞（IFN-γ+CD8+T细胞或TNF-α+CD8+T细胞），即促进了抗肿瘤免疫。
综上，抗IL-17A或抗PD-1联合抗IL-17A中和了肿瘤微环境中的IL-17A，均可减少耗竭性CD8+T细胞，增加细胞*性T细胞，从而增强抗肿瘤免疫。
图7
三、结论结直肠癌中，MondoA-TXNIP轴调控了肿瘤浸润性Treg的糖酵解，并进而影响了Treg细胞在肿瘤微环境中的功能。MondoA的敲除促进了Treg及其他T细胞分泌IL-17A从而促进了炎症相关结直肠癌的发生发展，因而靶向MondoA或IL-17A可能作为靶向清除肿瘤浸润性Treg，从而增强抗肿瘤免疫的靶点。
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