年7月1日，中山大学文石*教授团队在JournalofMedicinalChemistry期刊发表了题为“Design,Synthesis,andEvaluationofVHL-BasedEZH2DegraderstoEnhanceTherapeuticActivityagainstLymphoma”的研究工作。该研究基于PROTAC技术设计并合成了靶向EZH2的VHL-PROTAC分子，该分子能将E3泛素连接酶招募到PRC2复合体附近形成多元复合物，从而导致所有PRC2亚基的不加选择的泛素化和降解。该降解剂在淋巴瘤异种移植模型和患者来源的原发性淋巴瘤细胞中显示出良好的抗肿瘤活性，这可能为治疗淋巴瘤提供一种潜在的抗癌策略。
PRC2是一种保守的多组分转录抑制复合物，具有组蛋白甲基转移酶活性，催化组蛋白H3(H3K27me2/3)赖氨酸残基的二甲基化和三甲基化，并通过促进染色质沉默参与基本细胞过程的靶基因表达。哺乳动物PRC2复合体主要有四个关键亚单位：EZH1、EED、SUZ12和Rb46/48。PRC2复合物的过度激活通过沉默肿瘤抑制基因诱导恶性肿瘤的发生。作为PRC2的核心催化亚基，EZH2在乳腺癌、前列腺癌、肺癌和卵巢癌等多种癌症中经常高表达，并且EZH2的高表达与多种癌症的发生和预后不良有关。
EZH2的过度表达或功能获得性突变可在多种肿瘤中观察到，包括淋巴瘤，尤其是大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、T细胞急性淋巴细胞白血病、乳腺癌和前列腺癌。EZH2的致癌作用通常归因于其终产物H3K27me3介导的肿瘤抑制基因的表观遗传沉默。对抗PRC2活性的其他染色质重塑复合物(如SWI/SNF复合物)的特定亚基突变的缺失是EZH2激活的另一个主要原因。例如，在几乎所有上皮样肉瘤中，SWI/SNF亚单位INI1(由SMARCB1编码)的缺失导致EZH2的组成性激活。EZH2在SWI/SNF亚单位ARID1A、PBRM1和SMARCA4突变的癌症进展中的广泛作用也已在细胞系和体内模型中得到证实。
许多抑制EZH2甲基化酶活性的化合物被开发出来，并在血液系统恶性肿瘤以及实体瘤的临床前和临床试验中显示出有希望的抗肿瘤效果，这些实体瘤由于上述SWI/SNF亚单位突变的合成致死性而表现出强烈的EZH2依赖性。年，FDA批准最先进的EZH2抑制剂EPZ(tazemetostat)用于治疗转移性和局部晚期上皮样肉瘤。这些抑制剂通常与EZH2的SET结构域结合，并与辅因子S-腺苷甲硫氨酸(SAM)竞争，而不影响EZH2的蛋白质稳定性。然而，越来越多的证据表明EZH2的致癌功能并不完全依赖于其酶活性。整个EZH2蛋白本身也与肿瘤增殖相关，与其H3K27三甲基化活性无关。同时，发现了现有EZH2抑制剂的一些缺点，例如，剂量过大、获得性耐药以及对大多数实体瘤的药物不敏感。因此，作者假设在EZH2依赖性癌症中，降解整个EZH2蛋白而不是简单地抑制其酶活性的治疗效果可能更有效，而PROTAC技术似乎是解决该问题的一个有效方法。
调节PRC2稳态可能是治疗依赖或不依赖PRC2催化活性的癌症的有效方法。通过降解PRC2复合物中某个亚基使得PRC2复合物失去功能似乎是解决该问题的一种有效的手段。年，Ma等人1报道了一种基于HyT的EZH2选择性降解剂MS。MS在三阴性乳腺癌(TNBC)细胞中能有效降低了EZH2和SUZ12蛋白水平，而没有降低EED蛋白水平，并且在对EZH2抑制剂不敏感的多个TNBC细胞中显示出显著的抗增殖活性。年，研究者2-4报道了EED和EZH2蛋白靶向降解的PROTAC分子，该类降解剂能通过降解EED从而导致PRC2复合物的多种组分降解，如EED、EZH2和SUZ12。我们已熟知PROTAC分子能够将E3泛素连接酶与靶蛋白拉近从而形成复合物致使靶蛋白泛素化后被降解。通过PROTAC分子实现蛋白复合物亚基的分别泛素化后被降解，或者降解复合物中一种蛋白后使得复合物中其他亚基失去稳定性而被降解似乎能更大限度的突出PROTAC技术的优势。基于上述原理，作者设计了EZH2靶向的PROTAC分子，通过诱导PRC2复合物的耗尽，从而抑制EZH2的催化和非催化功能，从而实现广泛的抗癌活性。
在之前的工作中，作者发现EZH2抑制剂EPZ需要高剂量才能达到合理的体外抗增殖活性，尽管该化合物在纳摩尔浓度水平下主要抑制EZH2活性。由于淋巴瘤被认为对EZH2抑制剂更敏感，作者用不同种类的淋巴瘤细胞系筛选了EPZ细胞增殖抑制活性。尽管所有细胞系中EZH2蛋白水平相似，但大多数淋巴瘤细胞系对EZH2抑制没有表现出明显的反应。然而，EZH2基因敲除几乎完全抑制SU-DHL-2的细胞生长。这些结果证实了开发EZH2降解剂的必要性。基于PROTAC策略，作者将EPZ中的吗啉环末端作为PROTAC的Linker接入点设计合成了一系列的降解剂。
基于VHL和CRBN配体，作者设计合成了两类具有不同长度链长的PROTAC分子。通过WesternBlot实验，作者评价了这些化合物在不同浓度下降解EZH蛋白的能力，并从中筛选出了YM和YM作为最优分子做了进一步的评估。
接下来，作者研究了EZH2降解剂的效力。YM和YM在24小时内以浓度依赖性方式消除了EZH2蛋白水平和H3K27me3，并且对EZH1的蛋白水平没有显著影响。当浓度为2μM时，最大降解效率达到80%。时间依赖实验结果表明，EZH2降解可在2小时内检测到，并且该效应在4小时内达到最大值。为了测试EZH2降解剂对PRC2复合物的影响，用YM(2μM)处理的SU-DHL-2和22Rv1细胞中观察了其他两个亚单位EED和SUZ12蛋白质水平的降低。结果表明，YM和YM降解了EZH2蛋白，因此由于完整性的丧失而使PRC2复合物不稳定。或者，EZH2附近的EED和/或SUZ12也可能通过EZH2-PROTAC介导的三元复合物形成而泛素化。此外，作者也从机制上证明了这两种降解剂诱导的EZH2降解是与VHL依赖性泛素蛋白酶体系统有关
EZH2降解剂在淋巴瘤细胞系中显示出比EPZ更强的抗癌作用。与EPZ相比，YM和YM可诱导几乎完全的细胞活力抑制，尽管其初始有效浓度略高。同时，EPZ仅在SU-DHL-2和SU-DHL-4细胞中实现一半抑制，在SU-DHL-6中实现70%抑制。此外，对EZH2抑制剂耐药的所有其他淋巴瘤细胞系也显示出对EZH2降解剂的敏感性。
接下来作者分析了EZH2降解剂对淋巴瘤细胞周期和凋亡的影响。结果显示，在作用24小时后，EZP略微导致SU-DHL-6细胞G0/G1期阻滞，但未观察到亚G1期细胞显著增加。然而，相同剂量的YM和YM导致浓度依赖性的细胞周期停滞和亚G1期群体的显著增加。Caspase-3/7分析表明，EZH2降解剂增加了Caspase-3/7的活性，Westernblot也显示切割的Caspase-3和PARP显著增加，表明发生了细胞凋亡。Annexin-V/PI分析进一步证实两种EZH2降解剂以剂量依赖性方式明显诱导细胞凋亡，而EZP则没有。这些结果表明EZH2降解剂诱导明显的细胞周期阻滞和凋亡，这可能是YM和YM能够实现完全的细胞活力抑制的原因，而EPZ如果仅抑制EZH2的甲基化功能，则不能实现细胞活力的完全抑制。
为了研究EZH2降解剂的体内抗肿瘤活性，首次建立了DLBCL细胞系SU-DHL-6的异种移植小鼠模型。与体外结果一致，YM(80mg/kg)经腹腔注射6次每周，连续3周显著抑制肿瘤体积。然而，与YM相同摩尔剂量(42.5mg/kg)的EPZ则不能抑制肿瘤生长。EPZ和YM均未导致小鼠体重显著减轻。肿瘤组织的Westernblot分析显示，YM显著降低EZH2蛋白和H3K27me3水平。EPZ3没有阻止肿瘤生长，尽管它显著降低了H3K27me3水平，表明EZH2的酶抑制可能不足以在体内减弱淋巴瘤细胞。YM诱导的EZH2显著失稳和肿瘤增殖抑制通过肿瘤切片的免疫组织化学进一步证实。DLBCL的体内抗癌作用在Jeko-1(套细胞淋巴瘤细胞系)的小鼠异种移植模型中得到验证。更重要的是，YM治疗小鼠的肿瘤重量与EZH2蛋白水平明显相关。最后，为了评估EZH2降解剂的潜在临床意义，作者从各种淋巴瘤患者样本中提取的原发性淋巴瘤细胞用于进一步的试验，EZH2降解剂在所有不同的淋巴瘤细胞系中显示出很好的疗效。首先，EZH2降解剂YM在一名DLBCL患者的原代细胞中诱导剂量依赖性诱导EZH2降解。此外，对11例淋巴瘤患者(包括2例BLBCL)的淋巴瘤原代细胞进行了YM疗效检测。与EPZ相比，YM增加了Caspase-3/7的活性，同时降低了三磷酸腺苷(ATP)含量。
本文链接：