红细胞疗法—“现货型”的肿瘤免疫治疗
1.中心点
借助红细胞设计人工抗原呈递细胞(aAPC)，呈递与MHCI结合肽、4-1BBL和IL-12，体内研究显示生强大的抗原特异性T细胞扩增、记忆形成、免疫激活、肿瘤控制和抗原在扩散。由于脉管系统和脾脏限制，4-1BBL和IL-12引起最小*性。设计的同种异体aAPC—RTX-，包含HLA-A*02:01、HPV肽HPV16E-19、4-1BBL和IL-12，能够激活HPV特异性T细胞并促进体外效应功能。因此红细胞设计的人工抗原呈递细胞(aAPC)是一种潜在的“现成”体内细胞免疫疗法。
2.研究解析
2.1前言
有效的T细胞激活需要三个不同的信号：与MHC-肽结合TCR（信号1）；促进T细胞活化、功能和存活的共刺激信号（信号2）；和细胞因子信号，以促进T细胞进一步扩增和分化，增强效应功能和免疫记忆的形成（信号3）。信号1和2通常由APC传递。目前已经利用成纤维细胞、微珠、生物可降解聚合物和K细胞的树突状细胞或人工APC(aAPC)用于体内或体外刺激T细胞。
红细胞(RBC)具有独特的特性，使其对同种异体细胞疗法具有吸引力，包括使用O阴性供体血液固有的生物相容性，造成了输血医学的长期使用历史，几乎没有副作用。另外，红细胞与多种免疫特权机制相关，可保护它们免受抑制或不利的宿主反。从生产角度来看，造血祖细胞的细胞培养和分化允许红细胞增殖多倍。通过基因改造有可能产生生物治疗蛋白表达的工程化人类RBC（本研究称为RedCellTherapeutics??或RCTs?）。随着红细胞前体细胞去核，表达的蛋白质得以保留，但对祖细胞的遗传修饰不会带入用于患者给药的最终产品中。最后，由于红细胞被限制在大多数实质器官和脾脏的脉管系统中，它们有可能避免循环免疫调节蛋白出现的一些靶向*性。
本研究描述了同种异体红细胞治疗aAPC平台(RCT-aAPC)的开发、表征和临床前测试，证明了RCT-aAPC能够在体内外驱动抗原特异性T细胞扩增和效应功能，并且控制临床前小鼠模型肿瘤。
2.2RCT-aAPCs体外产生功能性CD8+T细胞
借助人CD34+造血祖细胞用于扩增并慢病*转导，然后扩增和分化为去核工程红细胞，以产生RCT-aAPC。使用慢病*载体编码鼠MHCIH-2Kb的单链三聚体和融合了卵清蛋白特异性肽SIINFEKL(OVA)的β-2微球蛋白(β2M)（信号1）、4-1BBL（信号2）和细胞因子IL-7（RCT-OVA-4-1BBL-IL-7）、IL-12（RCT-OVA-4-1BBL-IL-12）或IL-15（RCT-OVA-4）-1BBL-IL-15)作为信号3。采用OT-1细胞（一种TCR转基因细胞群），其表达识别与H-2Kb结合OVA肽的受体。与RCT-OVA-4-1BBL处理细胞相比，表达所有三种信号RCTaAPC处理的OT-1细胞能够对表达OVA的EG7具有增强的细胞*性，同时发现IL-12是最有效的细胞因子（图1a））。当使用亲本OVA阴性EL4细胞作为靶标时，发生最小的脱靶杀伤。
图1.RCT-aAPC和mRBC-aAPC体内外促进抗原特异性T细胞扩增、记忆形成和对肿瘤细胞的细胞*性
2.3RCT-aAPCs体内对T细胞表型、效应功能和抗肿瘤反应的作用
由于体内临床前模型评估RCT-aAPC的局限性，包括非人类物种中人类红细胞的快速清除，借助点击化将重组蛋白连接到小鼠RBC开发小鼠mRBC-aAPC，通过体外类似OT-1细胞增殖和IFN-γ产生，证明发现mRBC-aAPC是转基因工程红细胞的合适替代物。与mRBC-CTRL（未修饰的小鼠红细胞）、mRBC-OVA-4-1BBL或mRBC-OVA-4-1BBL-IL-7相比，mRBCOVA-4-1BBL-IL-12和mRBC-OVA-4-1BBL-IL-15在EG7-OVA荷瘤小鼠中诱导循环OT-1细胞显著扩增（图1b、c）。更重要的是，mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12和mRBC-OVA-4-1BBL-IL-15扩增的OT-1种群具有主要效应记忆(TEM)表型，同时仍保持大量的中央记忆(TCM))细胞群（图1d）。
接下来评估mRBC-aAPCs通过OT-1转移控制体内肿瘤生长的能力（图1e）。与PBS处理小鼠相比，在2.5×个细胞剂量下，mRBC-OVA-4-1BBL介导瞬时肿瘤生长抑制（图1f）且没有延长生存期（图1g）。与mRBC-OVA-4-1BBL和PBS对照相比，添加IL-12而不是IL-7或IL-15可改善肿瘤生长抑制（图1f）并延长存活时间（图1g），导致4/8治愈。此外，与1×mRBC-OVA-4-1BBL细胞（1/8小鼠）处理相比，低四倍剂量2.5×mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12细胞促进肿瘤消退（6/8小鼠）。与mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12相比，缺乏信号1的mRBC-4-1BBL-IL-12治疗仅产生1/8治愈，说明靶向肿瘤抗原对于疗效很重要。同时基于细胞因子功效以及肿瘤控制效力，IL-12被选为后续研究的最佳细胞因子。
另外发现，在EG7-OVA加OT-1转移模型，mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12治疗优于长OVA肽加不完全弗氏佐剂（IFA；图1i）的疫苗接种。接种长OVA肽加IFA后的OS为17.5天，与使用mRBC-CTRL观察到的中位OS（20天）相当，而mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12治疗后的中位OS为49天，使用mRBC-4-1BBL-IL-12治疗导致中位OS为28.5天，与mRBC-CTRL没有统计学差异，说明信号1是最佳疗效所必需的。只有mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12处理导致血液OT-1细胞显著扩增（图1j），这与疗效相关。
通过评估小鼠OT-1细胞和内源性免疫群体（图1k），发现mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12治疗后，OT-1细胞在循环中积累，并在肿瘤中以剂量依赖性方式增加（图1l）。TCRβ测序表明OT-1是血液和肿瘤中最丰富的T细胞克隆（图1m），并且mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12处理增加多功能（颗粒酶B+IFNγ+)肿瘤浸润OT-1细胞（图1n）。通过内源性CD8+T细胞Ki67、TNF-α和IL-2表达增加、肿瘤NK细胞Ki67和颗粒酶B增加、Treg%降低、CD4+T细胞中Th1%（IFNγ+Ki67+%）增殖、M1巨噬细胞%增加，证明mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12促进了通用的抗肿瘤免疫。
2.4mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12的物分布和耐受性
在有或没有OT-1转移的小鼠中重复给药mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12后进行安全性测试（图2a），与对照小鼠相比，体重也没有显著变化（图2b）。在给药阶段（最高剂量为1×细胞），血浆IFN-γ（图2c）和血清丙氨酸转氨酶（ALT）水平增加（图2d），但在2周恢复期后恢复到基线。在较低剂量3×细胞观察到*性最小，但这足以产生抗肿瘤功效（图1f，g）。同时检测包括脾脏和肝脏重量、肝酶水平、肝脏炎症和巨噬细胞浸润、血液学变化和血浆细胞因子水平，结果表明有或没有OT-1转移组*性类似最小和可逆。推测，相对于抗体和细胞因子，mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12缺乏显著*性可能是红细胞的生物分布受限。所有检测组织中都发现了最少的mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12，但脾脏除外（图2e）。
图2.mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12耐受性良好，优先生物分布到脾脏以促进T细胞相互作用
脾脉管系统的解剖结构允许红细胞直接与红髓实质的淋巴细胞相互作用，推测mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12可能参与T细胞的同源相互作用。1天之内内对脾脏的分析表明，与mRBC-CTRL相比，OT-1抗原特异性T细胞与mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12的接触频率更高，通过体外活细胞成像也证明了OT-1细胞和mRBC-OVA-4-1BBLIL-12之间的直接相互作用（图2f）。总体表明mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12能够与抗原特异性T细胞进行同源相互作用，并揭示脾脏可能是体内作用的主要部位之一。
2.5长期记忆形成和肿瘤再攻击的保护
对先前mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12治疗后治愈的EG7-OVA肿瘤小鼠，在初始肿瘤注射66天后再次接受EG7-OVA攻击。在EG7-OVA攻击前1天，年龄匹配的幼稚小鼠被转移OT-1细胞以代表OT-1细胞的残留背景水平（图3a）。五分之四的幼稚小鼠死于EG7-OVA攻击（图3b），并且在这些小鼠中OT-1细胞没有扩增（图3d）。相比之下，先前mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12治愈的所有七只小鼠在没有额外治疗的情况下，再次排斥了EG7-OVA再攻击（图3b）。这与肿瘤在攻击10天后OT-1和内源性OVA特异性T细胞扩增有关（图3c-e），说明mRBC-OVA-4-1BBL-IL-初始治疗后形成OVA特异性免疫记忆。
图3.mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12促进免疫记忆和表位扩散，并利用内源性T细胞
EG7-OVA第二次攻击后61天，治愈小鼠和年龄匹配的幼稚对照用亲本OVA阴性肿瘤细胞系EL4进行攻击。值得注意的是，与对照小鼠相比，先前治愈的小鼠表现出对肿瘤生长的抗性（3/7）或延迟的肿瘤生长（3/7）（图3f），这表明在诱导对EG7-OVA的免疫反应的过程中，mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12治疗导致表位扩散到其它肿瘤抗原。
TCRβ测序显示，先前治愈的小鼠在EG7-OVA攻击后OT-1克隆的频率增加（图3g）。而未接受治疗的小鼠在肿瘤攻击后OT-1频率没有增加，表明单独的肿瘤不足以驱动OT-1细胞扩增。另外还发现每次肿瘤攻击（EG7-OVA和EL4）时，EL4响应性TCR的频率增加与完全响应（排斥EL4攻击的小鼠）相关，这表明T细胞介导的针对亲本肿瘤抗原的保护是在EL4攻击之前产生的（图3h）。部分反应者（与幼稚小鼠相比，肿瘤生长延迟）在EL4攻击后但在EG7-OVA再攻击期间没有增加EL4反应性TCR频率，而无反应者（与幼稚小鼠相似的肿瘤生长）TCR频率增加最小。总体而言，控制EL4肿瘤能力与EL4反应性TCR克隆的扩增。
2.64-1BBL和IL-12驱动无OT-1转移的EG7-OVA肿瘤控制
在EG7-OVA肿瘤注射后的第二天，用mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12、mRBC-4-1BBL-IL-12或mRBC-CTRL同时无OT-1转移处理小鼠（图4a），与mRBC-CTRL相比，mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12治疗显著延迟了EG7-OVA肿瘤的生长并增加了中位OS（图4b）。与mRBC-CTRL相比，使用缺乏信号1的mRBCs，即mRBC-4-1BBL-IL-12，在1×和3×剂量下也延迟了肿瘤生长并增加了中位OS，这与mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12相比没有统计学差异。mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12和mRBC-4-1BBL-IL-12都扩增了血液中的内源性OVA特异性T细胞，但当信号1存在时（mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12），这种扩增的动力学明显更快（图4c）。总的来说，这些数据表明aAPC呈递抗原的存在导致抗原特异性T细胞的更快积累；然而，信号2和3（4-1BBL和IL-12）是观察到抗肿瘤作用的主要驱动因素。
图4.mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12和mRBC-4-1BBL-IL-12在无OT-1转移小鼠中延迟EG7-OVA肿瘤生长
2.7靶向gp的mRBC-aAPC促进抗原特异性pmel-1T细胞扩增并显著减少B16-F10肿瘤转移
将mRBC与不同的MHCIpeptide复合物-H-2Db偶联，其中H-2Db加载了gp肽，加上4-1BBL和IL-12产生mRBC-gp-4-1BBL-IL-12。在具有pmel-1（gp特异性）T细胞转移的B16-F10肺转移模型中（图5a），观察到mRBC-gp-4-1BBL-IL-12对肺转移治疗呈现剂量依赖性作用。最高剂量几乎消除了它们（图5b、c）。与mRBC-CTRL相比，加PD-1抗体治疗肺转移没有影响。1×剂量治疗在血液、脾脏和肺中检测到增加的pmel-1细胞（图5d-f）。此外，用mRBC-gp-4-1BBL-IL-12处理增加了肺浸润抗原特异性pmel-1细胞的总数，这些细胞显示出效应功能的标志物（IFN-γ和颗粒酶B；图5g）。内源性T细胞也浸润到肺，同时伴随着IFN-γ和颗粒酶B的增加（图5g）。
图5.靶向肿瘤相关抗原(gp)的mRBC-aAPC促进抗原特异性pmel-1T细胞扩增和效应功能，并显着减少B16-F10肿瘤肺转移
2.8RTX-激活HPV特异性、TCR转导的原代人类T细胞
为治疗HPV16+癌症患者，开发了RTX-，它由同种异体培养的人去核红细胞，经过工程改造以表达与HPV16E-19肽(HLA)融合的HLA-A*02:01和β2M的单链三聚体-A2-HPV（信号1）、4-1BBL（信号2）和IL-12（信号3）（图6a）。用慢病*转导HLA-A*02:01供体CD8+T细胞以表达HPVE7特异性TCR29（E7-TCR细胞）（图6b），并与RTX-或表达RTX-各种成分的工程化红细胞共培养。此外，通过测试呈递巨细胞病*(CMV)肽而不是HPV16E-19肽(RCT-CMV-4-1BBL-IL-12)的RCT-aAPC来评估抗原特异性。
图6.RTX-在体外驱动原代抗原特异性T细胞扩增、激活、记忆分化和效应功能
共培养2或24小时分别显著增加了E7-TCR细胞Nur77和CD69表达，表明TCR的生产性连接（图6c，d）。TCR信号不依赖于4-1BBL和IL-12表达，因为单独表达HLA-A2-HPV的工程化红细胞能够诱导这些激活标记（图6c、d）以及4-1BB（图6e）。虽然单独的HLA-A2-HPV（信号1）足以激活T细胞，但所有三个信号都是T细胞扩增所必需的（图6f），伴随着颗粒酶B和IFN-γ分泌的诱导（图6f）。与RTX-（而非RCT-CMV-4-1BBL-IL-12）共培养导致E7-TCR细胞扩增，这表明扩增是由抗原特异性驱动的。响应RTX-扩增的CD8+T细胞包括TCM和TEM细胞组成（图6h）。TCM细胞的增加主要取决于信号1和2，而所有三个信号都有助于TEM细胞的增加。这些数据表明，RTX-促进原代CD8+抗原特异性T细胞的扩增，诱导效应分子产生，并以抗原特异性方式增加T细胞活化以及TEM和TCM表型产生。
3.总结思考
3.1管线简析
RubiusTherapeutics，年由麻省理工学院和FlagshipPioneering联合成立。不同于其它公司“改造成熟的红细胞”，Rubius利用造血干细胞和基因编辑技术“创造新的红细胞”。流程如下：先从单个健康的O-型血的志愿者体内收集CD34+造血干细胞，通过病*载体转染等技术对细胞进行基因工程改造，之后对细胞进行增殖和定向分化，使其分化为成熟的无核红细胞，最终制成细胞治疗产品——通常一个健康的志愿者制备的样本可以制备-0份off-the-shelf的成品。
目前Rubius红细胞平台技术衍生出三种不同应用
1.红细胞内部表达代谢酶，形成生物反应器，作为长效的酶替代疗法用于罕见病；Rubius先导产品RTX-用于苯丙酮尿症的酶替代疗法在年刚使用了一个患者就马失前蹄，获得"无法解释"的数据："临床试验中没有发现不良事件，RTX-耐受性良好；对于临床试验中首个患者出现无法解释的数据，部分原因可能是给药量不足或流式细胞仪的灵敏性"。但后面很诚实地宣布改变策略，将研发重点转向癌症和自免领域
2.红细胞表面表达免疫激活信号或肿瘤杀伤物质用于肿瘤免疫治疗；一个候选药物RTX-，是一种共表达免疫刺激单元4-1BB配体和IL-15的红细胞疗法，动物实验表明RTX-具有较强的免疫刺激和抗肿瘤活性，且无*副作用。年临床显示RTX-在经治的实体瘤的特定患者中产生了临床获益：包括1例确认的PR（肛门癌）、1例未确认的PR（葡萄膜黑色素瘤）、4例SD（NSCLC、STS、胰腺癌和前列腺癌各1例）。另一个RTX-，与RTX-类似，只是换成了IL-12：可以促进Th1免疫、T细胞及NK细胞增殖、CD8+T及NK细胞的细胞*作用和IFNγ的分泌。另外就是本研究的RTX-这种基于aAPC，除了激活，还通过表达MHC呈递特定的抗原肽，具备1+2+3完整的免疫信号，来促进对特异的免疫应答。
3.红细胞表面表达免疫耐受或中和性物质用于自身免疫性疾病治疗。
这种基于通用型造血干细胞的技术，使得Rubius能够规模化生产即用型红细胞药物。利用单一供体的造血干细胞，Rubius能够规模化生产倍~0倍剂量的即用型红细胞药物，而不再局限于个体治疗。预计未来，Rubius细胞培养产能将超过L/月，实现红细胞药物大规模量产，大大降低了生产成本，减轻患者负担。
3.2研究思考
本研究除了负载肿瘤抗原的MHCI（信号1），还使用4-1BBL作为T细胞共刺激配体（信号2）。4-1BBL与T细胞的4-1BB结合可促进T细胞存活和增殖，增强效应子功能，并且对于免疫记忆的形成至关重要。在CAR-T临床试验中，与CD28相比，4-1BB共刺激域的结合有利于Tcm细胞发育和T细胞持久性。IL-12细胞因子（信号3）可诱导NK以及CD4+和CD8+T细胞释放IFN-γ。此外通过STAT4的IL-12信号传导对于Th1分化和CD8+T细胞的细胞*活性至关重要。通过促进抗原特异性T细胞扩增、记忆和效应功能以及肿瘤控制导致最佳效果，说明IL-12是一种有效促炎细胞因子。
mRBC-aAPC不仅可以驱动对外来抗原OVA抗肿瘤反应，还可以驱动对天然表达肿瘤抗原gp的抗肿瘤反应。与使用长肽加IFA疫苗接种相比，mRBC-aAPC治疗提供了更好的生存益处，结果表明mRBC-aAPC形式提供了疫苗和佐剂可能无法提供的额外治疗益处。另外，静脉注射mRBC-aAPC似乎仅限于脾脏的循环开放脉管系统。mRBC-aAPC膜结合4-1BBL和IL-12，保留了良好的安全性，小鼠体重没有显著变化，脾肿大、肝脏炎症、ALT升高和IFN-γ变化都很小，而且可逆，这可能是mRBC-aAPC的脉管系统和脾脏生物分布以及4-1BBL和IL-12的膜结合性质，限制了它们靶外组织外*性。
重要的是，在EG7-OVA模型中治愈的小鼠不仅对EG7-OVA肿瘤细胞的再攻击具有抗性，而且对缺乏OVA的亲本EL4细胞系的攻击具有抵抗力，这表明记忆形成和表位扩散。虽然之前已经通过过继转移预活化或转基因T细胞证明了表位传播，但在这里，发现设计为人工APC的红细胞可以通过幼稚T细胞转移促进体内表位传播。另外，数据表明mRBC-aAPCs不仅驱动抗原特异性T细胞的激活和扩增，而且还促进肿瘤微环境的变化，包括内源性T细胞的增加、Treg数量减少、增殖性Th1细胞和M1巨噬细胞增加。这些变化可能有助于抗原扩散，并且保护缺乏靶抗原肿瘤细胞重新攻击的动物。最后，广泛的免疫激活可能有助于提高长肽疫苗接种的功效。
HPV+癌症患者在其循环中具有不同频率的HPV抗原特异性T细胞。通过存在或不存在OT-1过继转移对患者的抗原特异性T细胞频率范围进行建模。具有高频率的抗原特异性T细胞（即具有OT-1过继性转移），提供所有三种信号的mRBC-aAPC比缺少信号1的mRBC-aAPC更有效。然而，由于抗原特异性T细胞的频率较低（即没有OT-1转移），观察到与mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12和mRBC-4-1BBL-IL-12相似的功效。这表明在没有OT-1转移的模型中，抗肿瘤作用的主要驱动因素是mRB-CaAPC的4-1BBL和IL-12成分。尽管信号1提供导致靶抗原特异性T细胞的早期扩增，但这并没有转化为对肿瘤生长的额外影响。因此，这些信号在临床中的相对重要性可能取决于患者中预先存在的靶抗原特异性T细胞的数量。
该研究提出了一种基于基因工程RBC的aAPC平台，用于治疗癌症，并展示了这种方法在原代人类细胞中的活性。几十年来，红细胞一直用于输血医学，O阴性供体血液可以可靠地输给大多数人群。同种异体工程红细胞可以在多个患者中给药，并使用可扩展的生产工艺生产，而无需TCR-T细胞和CAR-T疗法中复杂、个性化的生产工艺。RCT-aAPC平台展示了广泛的抗原适用性，旨在模拟T细胞-APC相互作用的生物学特性，作为免疫治疗剂在一系列癌症具有潜在应用。
4.参考文献
1.ZhangXuqing,LuoMengyao,DastagirShamaelRetal.Engineeredredbloodcellsasanoff-the-shelfallogeneicanti-tumortherapeutic.[J].NatCommun,,12:.
2.Barrueto,L.etal.Resistancetocheckpointinhibitionincancerimmunotherapy.Transl.Oncol.13,738()
3.Li,D.etal.GeneticallyengineeredTcellsforcancerimmunotherapy.SignalTransduct.Target.Ther.4,1–17().
4.Hay,K.A.CytokinereleasesyndromeandneurotoxicityafterCD19chimericantigenreceptor-modified(CAR-)Tcelltherapy.Br.J.Haematol.,–().
5.Harrison,R.P.,Zylberberg,E.,Ellison,S.Levine,B.L.Chimericantigenreceptor-Tcelltherapymanufacturing:modellingtheeffectofoffshoreproductiononaggregatecostofgoods.Cytotherapy21,–().
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