前言
近年来，免疫治疗在开拓和加速肿瘤治疗领域方面显示出了巨大的潜力，并在临床实践中取得了前所未有的突破。CRISPR-CAS9系统作为一种多用途的基因编辑技术，为有效地创新肿瘤研究和肿瘤治疗奠定了坚实的基础。CRISPR/Cas9与肿瘤免疫治疗这两项肿瘤研究和治疗革命性技术的结合，可能进一步拓宽免疫治疗在更多肿瘤患者中的应用。
CRISPR/CAS9在CAR-T治疗中的应用
目前，CAR-T细胞治疗已经在血液恶性肿瘤中显示出前所未有的疗效。CAR结构由三部分组成：细胞外抗原识别结构域（通常是来自抗体的scFv）、跨膜结构域和含有CD3ζ的细胞内信号转导结构域，新一代的CAR带有共刺激分子。
尽管已经取得了令人印象深刻的临床结果，但由于多种原因，许多患者仍然无法从CAR-T细胞治疗中获益。首先，制造T细胞的个性化方法费时且昂贵，这阻碍了许多患者，尤其是疾病快速进展的患者充分利用这种免疫疗法；第二，在生产过程中，淋巴细胞减少的患者很难产生足够高质量的T细胞，即使患者获得足够的免疫细胞，这些细胞也可能无法完成整个制造过程；最后，自体CAR-T产品的异质性可能会导致不可预测和可变的临床结果。
CRISPR/Cas9产生通用异基因CAR-T细胞
为了克服限制CAR-T细胞治疗广泛应用的障碍，人们提出了多种治疗策略。最可行和持久的方法之一是从健康捐赠者中产生异基因通用CAR-T细胞。与自体CAR-T细胞相比，“现成”的同种异体CAR-T细胞具有许多潜在优势，包括可立即为急需的患者提供冷冻保存的CAR-T细胞、首次输注或再给药的足够数量以及CAR-T细胞生产标准化。考虑到供者T淋巴细胞上存在内源性HLA和TCR，通用产品的最大挑战是同种异体反应和移植物抗宿主病（GVHD）的潜在风险。
随着基因编辑技术的进步，人们逐步实现了内源性TCR的根除。通过锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活物样效应器核酸酶（TALENs），人们都制造出了敲除TCR的CAR-T细胞。然而，完全同种异体CAR-T细胞的产生需要同时敲除TCR和HLA分子并转导CAR，这需要一种更高效和精确的基因编辑技术来实现。
与ZFNs和TALENs相比，CRISPR/Cas9具有良好的柔性和高效性，在异基因CAR-T细胞的制备中有着广泛的应用。CRISPR/Cae9可以同时高效地敲除多个基因位点。Ren等人使用CRISPR/Cas9产生同时敲除内源性TCR、HLA-I和PD-1的CAR-T细胞，其在体外和动物模型中显示出强大的抗肿瘤活性。CRISPR/Cas9编辑的通用CAR-T细胞在体内的安全性和有效性有待于临床研究的进一步检验，目前，共有8项相关的临床试验正在进行。
CRISPR/Cas9增强CAR-T细胞功能
尽管在血液系统恶性肿瘤中取得了显著的成功，但由于免疫抑制性肿瘤微环境和T细胞衰竭，仍有许多患者的CAR-T细胞治疗不理想。由于共抑制分子（如PD-1、CTLA-4、LAG-3和TIM-3）在T细胞功能障碍中的重要作用，CRISPR/Cas9也被用于破坏这些抑制基因以增强CAR-T细胞功能。
CRISPR/Cas9介导的PD-1敲除被证明增强了CAR-T细胞在体外杀死肿瘤细胞以及在体内清除PD-L1+肿瘤异种移植物的能力。除共抑制基因外，CAR-T细胞中的二酰甘油激酶（DGK）敲除可提高抗肿瘤免疫。敲除粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）基因可增强CAR-T细胞功能，降低细胞因子释放综合征（CRS）和炎症的风险。研究也证实了在CAR-T细胞中敲除内源性TGF-β受体II（TGFBR2）可以减少CAR-T细胞的耗竭，提高体内外针对实体瘤的杀伤效果。此外，通过CRISPR/Cas9清除CAR-T细胞中的CD7和TRAC，可提高治疗T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）的疗效。
CRISPR/CAS9在TCR-T细胞治疗中的应用
众所周知，CAR-T细胞在实体瘤中的作用有限。肿瘤特异性抗原缺乏、肿瘤抗原异质性和肿瘤微环境抑制是其主要原因。与CAR-T免疫疗法相比，工程化TCR-T细胞疗法在靶向更广泛的抗原方面具有更大的前景，从而扩大了治疗癌症的范围。
T细胞受体是表达在T细胞膜上的一种抗原识别结构。TCR由异二聚体的α链和β链组成，两条链都含有可变抗原结合区、细胞外恒定区和跨膜区。TCRα/β链的恒定区和CD3(γ,δ,ζ,ε)形成TCR/CD3复合物。TCR/CD3复合物以主要组织相容性复合物（MHC）依赖的方式识别肿瘤抗原。
肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的天然TCR特异性已被成功地用作过继细胞治疗，并且在一些实体肿瘤中取得了显著的临床反应。具有工程化肿瘤特异性TCR的T细胞也在包括黑色素瘤在内的几种癌症中也显示出有希望的治疗潜力。
然而，TCR-T细胞治疗的主要问题之一是受体T细胞上存在内源性TCR。内源性TCRs与转基因TCRs竞争CD3的结合，此外，内源性TCR与转基因TCR的错配也可能导致混合TCR二聚体的形成。
为了解决这些问题，CRISPR/Cas9系统被用来把内源性TCRα和β基因替换成具有人工肿瘤特异性TCR序列的基因。与传统的TRC-T细胞相比，敲除内源性TCR可提高转基因TCR的表达和功能。此外，动物模型中CRISPR/Cas9修饰T细胞的抗肿瘤反应增强。
为了减少错误配对的风险，另一个策略是替换成一个稳定的Vα/Vβ单链TCR（ScTCR）。据报道，通过CRISPR/Cas9转导Sc-TCRs几乎完全消除了TCR错配。年，CRISPR/Cas9编辑的TCR-T细胞首次在难治性癌症患者中进行了临床试验，对安全性和可行性进行评估。通过分离患者自体T细胞，慢病*转导表达NY-ESO-1和LAGE-1特异性TCR，然后用CRISPR/Cas9破坏内源性TCRs和PD-1基因。CRISPR修饰的T细胞在体外扩增后回输3例患者。两名患者病情稳定，另一名患者病情进展。
免疫检查点信号通路的抑制
近年来，免疫检查点分子因其在抗肿瘤免疫中的重要作用而受到癌症研究的广泛