今天分享一篇年4月份发表在Adv.Mater.上的文章，该文的通讯作者是华南理工大学的唐本忠教授、华南理工大学的赵祖金教授与中国地质大学的娄筱叮教授。唐本忠教授的主要研究领域是高分子合成方法论的探索、先进功能材料的开发以及聚集诱导发光现象的研究；赵祖金教授的主要研究领域是有机/高分子光电功能材料，聚集诱导发光，生物成像诊疗；娄筱叮教授的主要研究领域是多功能聚集体设计及应用。该文的第一作者是RumingJiang。
癌症每年夺去数百万人的生命，已成为人类健康的严重威胁。手术是目前临床应用最广泛的实体瘤患者的治疗方法。虽然手术治疗可以有效切除肉眼可见的肿瘤，但是手术切缘率低，一些微小肿瘤在术中被遗漏，肿瘤未能被完整地切除，从而导致患者由于残留病灶和肿瘤复发治疗失败。肿瘤手术导航技术可以术中实时光学定位肿瘤，为肿瘤切除手术提供更加客观有效的肿瘤位置信息，辅助医生完整的切除肿瘤，从而提高手术效率，降低手术风险。近红外II区(NIR-II)荧光成像，具有组织穿透深度深和自发荧光低等优点，能够作为外科医生的第三只眼睛，帮助外科医生识别并切除所有肿瘤，是术前诊断和术中导航的理想选择。但是手术切缘率不到百分之百。近年来，光疗逐渐成为肿瘤治疗的主要手段。光热疗法(PTT)和光动力疗法(PDT)通过将吸收的光能有效地转化为局部高温或产生*性活性氧(ROS)杀死肿瘤细胞。
基于此，该文作者基于单一的聚集诱导发光分子（AIEgen）开发了一个多功能治疗纳米平台，实现了NIR荧光、光热、光动力学、免疫疗法四效合一。这种以单一AIEgen为基础的治疗策略显著提高了癌症小鼠的生存率，为癌症的临床治疗带来了巨大的希望。
图1DDTBNPs的设计策略。(A)设计合理的NIRAIEgen，具有多功能性能。(B)光物理过程的示意图。(C)DDTB-DPNPs的制备程序。
作者利用三苯胺作为供体单元与转子，苯并噻二唑作为强受体单元，合成了这种D–π–A–π–D共轭小分子。首先这种高度扭曲螺旋桨式结构抑制了分子间的π-π堆积，促进了AIE的产生。其次，高度扭曲的构象会延长分子间的距离。即使在聚集态时，也能保持松散的分子间堆积，保留分子间的旋转空间，从而增强了光热转化效率。作者计算了HOMO与LUMO的能极差，发现能极差低至1.38eV。同时由于DDTB结构中可以发生分子内电荷转移（ICT）使分子的波长红移。因此DDTB分子具有AIE性质和NIRⅠ、II区荧光。DDTB分子具有光动力治疗、光热治疗、手术导航、免疫疗法四种功能。如图1B所示，基态分子吸收光被激发跃迁到激发态，激发态的能量一部分通过荧光散失，一部分以非辐射方式通过热能散失，还有一部分通过系间窜越跃迁到三线态，将能量传递给周围的氧气生成单线态氧。作者利用纳米沉淀法将上述分子与两亲性共聚物DSPE-PEG组装成纳米颗粒，将纳米颗粒注射到荷瘤小鼠的体内。
图2DDTB-DPNPs在NIR成像引导手术—PTT/PDT的应用。
将纳米颗粒注射到荷瘤小鼠体内，纳米颗粒由于EPR效应集中于肿瘤部位，借助纳米颗粒的NIR-II区荧光进行荧光导航指导手术，对残余的微小肿瘤进行术中PDT-PTT治疗，图2E是将纳米颗粒注射到荷瘤小鼠体内，进行荧光指导肿瘤光疗，同时注射PD-L1抗体联合光疗。在术中荧光导航下，将传统手术与PTT和PDT相结合的治疗纳米平台，可以克服各自的局限性，最大限度地杀伤肿瘤细胞和组织，实现最大的治疗结果和生存率。
图3DDTB及其对应NPs的光物理、光动力学和光热性质。(A)DDTB在四氢呋喃中的紫外可见光谱。(B)不同水体积分数(fw)的四氢呋喃/水混合物中DDTB的荧光强度变化。(C)nm激光照射下，DDTB在N,N-二甲基甲酰胺溶液中的光热转化行为。(D)DDTB-DPNPs的动态光散射尺寸和透射电子显微镜图像。(E)NPs在水溶液中的吸收和发射光谱。(F)DDTB-DPNPs水溶液温度升高。
作者对DDTB及NPs进行了光物理、光动力、光热性质表征。DDTB在四氢呋喃中在nm有强的吸收峰（图3A）。作者发现通过进一步增加水的比例,荧光强度显著增加，符合AIE机制（图3B）。DDTB的光热效应良好，用近红外激光(nm)照射3min后，DDTB溶液温度迅速升高，达到91℃，表明了溶液中激发态的能量主要通过分子剧烈运动转化为热能散失（图3C）。由于DDTB很难溶于水，为了增加生物相容性，作者采用纳米沉淀法将DDTB包封进两亲性共聚物中制备成纳米颗粒。使用动态光散射，测量纳米颗粒的流体动力学直径.5nm（图3D）。DDTB-DPNPs在nm处有明显的吸收峰，在可见光到NIR区域有较宽的吸收带(-nm)。在水溶液中，DDTB-DPNPs的在nm有荧光峰，Stokes位移为nm（图3E）。DDTB-DPNPs近一半的荧光光谱位于NIR-II窗口(超过nm)，表明该NPs具有作为NIR-II荧光探针的巨大潜力。此外，作者还研究了DDTB-DPNPs在NIR激光(nm)照射的光热效应。在NIR激光照射5min后，DDTB-DPNPs水溶液的温度很快达到最大值84.7℃，光热转换效率可达30.7%。因此，DDTB-DPNPs作为明亮的NIR-II荧光探针具有巨大潜力，具有良好的光热稳定性。
图4体外细胞实验。(A)不同肿瘤细胞(A、MDA-MB-、SKOV-3、PC3和HeLa)随照射时间的温度变化。(B)使用nm激光照射，用DDTB-DPNPs和PBS孵育不同肿瘤细胞的红外热像图。(C)检测NPs作用不同肿瘤细胞8h的活性。
作者进一步研究了DDTB-DPNPs在NIR激光照射下对肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、宫颈癌5种不同癌细胞的杀伤作用。用DDTB-DPNPs培养细胞8h后，将癌细胞消化并离心，获得含有NPs的细胞。如图4B，在NIR激光照射下，所有携带NPs的癌细胞的温度都迅速升高，而PBS处理的细胞的温度几乎没有变化。为了直观地证明这些DDTB-DPNPs的杀伤癌细胞能力，采用碘化丙啶(PI)作为探针，选择性染色死亡细胞，进行了死亡细胞染色实验。仅用NIR激光照射的对照组几乎没有观察到红色荧光,而用DDTB-DPNPs处理随后的NIR激光照射组则表现出明亮的红色荧光，表明DDTB-DPNPs具有较强的光*性。
图5成像引导下DDTB-DPNPs对荷瘤小鼠的协同治疗效果。(A)成像指导手术联合PTT/PDT治疗肿瘤的示意图。(B)小鼠治疗后，生物发光图像监测肿瘤复发。(D)不同荷瘤小鼠组的平均肿瘤生长曲线。(E)治疗后各组肿瘤复发率。
随后作者将PTT、PDT与荧光图像引导手术相结合的多模式肿瘤治疗方案用于活体内研究。如图5A所示，作者培养表达绿色荧光蛋白(EGFP)的肿瘤细胞，将这种生物发光的肿瘤细胞注射到小鼠体内建立生物荧光荷瘤小鼠模型，用生物发光以精确评估治疗后肿瘤复发情况。荷瘤小鼠随机分为4组，采用不同的治疗策略:对照组(小鼠不接受手术治疗)、手术组(无图像引导手术)、图像手术组(图像引导手术)、图像手术-PTT/PDT组(图像引导手术及术中光动力和光热治疗)。通过体内生物发光(图5B)和卡尺测量(图5D)监测肿瘤生长。值得注意的是，在图像手术-PTT/PDT组中，10只小鼠中只有1只肿瘤复发，证实了图像手术-PTT/PDT组治疗效果令人满意。根据图5B、D所示结果，肿瘤的复发率为对照组(%);手术组(80%);图像手术组(50%);图像手术-PTT/PDT(10%)(图5E)。因此，协同成像引导手术与PTT/PDT比其他治疗方法具有更好的治疗效果，克服了各自的局限性，具有广阔的临床应用前景。
图6联合DDTB-DPNPs介导的PTT/PDT和PD-L1抗体的肿瘤免疫治疗。(A)、(D)荷瘤小鼠的代表性肿瘤图片。(B)、(E)治疗后不同时间荷瘤小鼠肿瘤体积生长曲线。CD8+T细胞（H）、TNF-α（I）和IFN-γ（J）在外周血中的比例。(K)肿瘤CD4+、CD8+T细胞浸润的免疫荧光染色。
作者最终评价NPs加PD-L1抗体在光照射下是否能改善小鼠原发肿瘤的抗肿瘤免疫系统，用于现代肿瘤免疫治疗。PD-L1是一种重要的免疫检查点，PD-L1抗体可抑制T细胞活化，重新激活T细胞对肿瘤细胞的免疫应答，达到抗肿瘤的效果。分别用B16-F10和4T1肿瘤细胞建立了黑色素瘤和乳腺肿瘤两种异种移植瘤模型。治疗在静脉注射后24小时进行。根据肿瘤照片(图6A,D)和肿瘤生长曲线(图6B,E)，与PBS和NPs组相比，NPs+激光和PD-L1抗体单独组在两种肿瘤中均能有效抑制肿瘤的生长。结果发现，NPs+激光+PD-L1抗体的抗肿瘤效力最好，大部分肿瘤均被消融而无复发，说明DDTB-DPNPs介导的PTT/PDT与PD-L1抗体联合治疗可提高疗效。免疫荧光成像进一步证实PTT/PDT和PD-L1抗体联合应用对肿瘤免疫治疗有显著改善。NPs+激光+PD-L1抗体组中负责抗肿瘤免疫的细胞*性CD8+T淋巴细胞显著增加。此外，作者发现荷瘤小鼠外周血T细胞释放的多种细胞因子，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(IFN-γ)的浓度也显著增加，特别是在DDTB-DPNPs介导的PTT/PDT+PD-L1处理的小鼠中。因此，DDTBNPs介导的PTT/PDT与PD-L1抗体联合可有效诱导抗肿瘤免疫系统，获得满意的肿瘤免疫治疗效果。
该文作者开发了一种新型多功能治疗纳米平台（DDTBNPs）用于肿瘤的诊断与治疗，DDTBNPs具有较强的NIR荧光(nm)，高效的ROS生成效率和光热转换效率(30.7%)。在术中荧光导航下，将传统手术与PTT/PDT相结合的治疗纳米平台，可以实现最大的治疗结果和生存率。DDTBNPs介导的PTT/PDT和PD-L1抗体的肿瘤免疫治疗对小鼠原位肿瘤的杀伤效果显著提高。临床诊断成像和治疗技术相结合，为临床应用实现更精确、更特异的治疗。
作者：刘继红
核稿者：丁琪
上传者：苏迪
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