(Balachandran,YL.LiX,JiangX.IntegratedMicrofluidicSynthesisofAptamerFunctionalizedBiozeoliticImidazolateFramework(BioZIF-8)TargetingLymphNodeandTumor.NanoLett.,21,?)
制备表面配体功能化的纳米材料在生物应用方面具有很好的潜力，因为这种纳米材料可以与特定的器官/细胞发生精准的反应，如使用纳米材料靶向递送治疗分子以引发对疾病的特异性反应。迄今为止，已经探索了许多方法来合成功能纳米材料。但是大多都有一些局限性，例如需要多步合成、重复性差、使用特殊仪器或环境。在此报道中开发了一种多功能的微流控方法来制备配体功能化的BioZIF-8MOFs，它能够作用于淋巴结和肿瘤等靶向器官中，在其进行大量的积累。
本文主要讲述了用一种集成微流控芯片来合成适体修饰的生物沸石咪唑骨架(BioZIF-8)的方法，并用来靶向淋巴结和肿瘤。主要分为两个阶段(图1)。第一阶段形成了ZIF-8包封生物分子，比如牛血清白蛋白（BSA）、小干扰核糖核酸（siRNA）和阿霉素（DOX）。以BSA为例，第一阶段由两个进气道(一个为中心进气道)和一个双螺旋混合通道组成，在前两个入口分别注射硝酸锌和2-甲基咪唑+BSA混合溶液(中心入口)，形成BioZIF-8MOFs。第二阶段是用适配体修饰BioZIF-8的表面。它包括一个中心入口，一个混合螺旋通道和一个出口，将适配体注射到第三个入口(第二个中心入口)，使BioZIF-8表面功能化。与传统两步法相比，作者采用新的工艺方法缩短了总合成时间(3mg/10min，而传统两步法为15小时)，并封装了更多的生物分子。微流控方法实现了功能MOFs的快速精细合成。
图1.适配体功能化BioZIF-8MOFs的合成。
为了确认BioZIF-8MOFs包裹性，用荧光染料对生物分子进行了标记，用Cy5染料标记siRNA，荧光素异硫氰酸酯(FITC)染料标记BSA，紫外可见光谱证实对了DOX的包封。从图2A-C可以看出，BioZIF-8MOFs相比于纯的ZIF-8MOFs有很好的生物分子封装能力。除此之外，将微流控法与与传统的水热合成作比较来测定制备的BioZIF-8MOFs的包封效率(图2D-F)。BioZIF-8MOFs对BSA的包封率为59%，对DOX的包封率为47%，对siRNA的包封率为53.5%，明显高于水热法包封的BioZIF-8MOFs(BSA为43%;阿霉素为34.5%;siRNA为37.3%)。因为双螺旋通道的横向剪切力混合强烈，缩短了混合距离以及时间，因此，微流控方法可以将更多的生物分子封装到BioZIF-8MOFs中。
图2.BioZIF-8MOFs对生物分子的包裹性。
肿瘤的微环境是酸性的，而ZIF-8MOFs是具有pH响应性，典型的ZIF-8MOFs在酸性条件下时失效，在中性时稳定，这些特点适用于肿瘤治疗。在此评估了DOX
BioZIF-8MOFs在不同pH下的药物释放以及肿瘤细胞的活力和细胞成像。将DOXBioZIF-8MOFs暴露于不同pH(pH5.5~pH7.4)的PBS中进行DOX释放。测定溶液中不同时间点DOX的释放度。随着pH值的增加，DOX的释放速度加快;但是pH值为7.4时，释放缓慢(图3A)。从图3B中可以看出，当DOX浓度高于2μg/mL时，细胞活力明显下降，说明了DOXBioZIF-8MOFs对前列腺肿瘤细胞具有很强的细胞*性。用共聚焦显微镜更加清晰的观察了游离DOX和DOXBioZIF-8MOFs在细胞内的分布，暴露于DOXBioZIF-8MOFs的前列腺细胞比暴露于游离DOX的前列腺细胞显示出更强的荧光(图3C)。图3.BioZIF-8MOFs的生物学评价。
因为BioZIF-8MOFs具有正的表面电荷，DNA/RNA适配体可以静电结合到表面，为了靶向肿瘤，我们使用了anti-CCL21DNA适配体和A10RNA适配体。anti-CCL21DNA适配体能够靶向淋巴结的T细胞，A10RNA适配体能够识别前列腺癌细胞表面的前列腺特异性膜抗原(PSMA)的胞外结构域。由于核酸适配体的修饰，BSA
ZIF-8MOFs的表面电荷由正(+23.5mV)转变为-15.7mV(anti-CCL21DNAaptamer-BSAZIF-8MOFs)和-13.8mV(A10RNAaptamer-BSAZIF-8MOFs)(图4A)。为了证明适配体功能化MOFs的包封和吸附效率。采用FITC标记BSA，用Cy5染料标记核酸适配体。适配体功能化的MOFs显示约57%的BSA包裹(图4B)，72%的anti-CCL21DNA适配体吸附(图4C)，69%的A10-RNA适配体吸附(图4D)。说明适配体功能化MOFs具有优异的包裹生物分子的能力以及很高的功能化分子吸附效率。图4.BioZIF-8MOFs对DNA/RNA适配体的吸附性。
为了观察材料在体内的靶向作用，用FITC标记了封装的BSA，以追踪aptamer-BSA
ZIF-8MOFs在淋巴结和肿瘤的积累。利用小鼠模型评估了aptamer-BSAZIF-8MOFs对淋巴结(图5A)和肿瘤的靶向效率(图5D)。用neatFITC-BSAZIF-8MOFs作为对照。anti-CCL21DNAaptamer-BSAZIF-8MOFs主要靶向于淋巴结，通过皮下注射或脚垫注射给药。经过48小时后手术切除左侧腹股沟淋巴结和腋窝淋巴结，进行体外荧光强度测定。无论给药途径如何，anti-CCL21DNAaptamer-BSAZIF-8MOFs均在左侧腹股沟淋巴结和腋窝淋巴结等淋巴结中显著积累(图5A，B)。除此之外，淋巴结测量的平均荧光强度显示，anti-CCL21DNAaptamer-BSAZIF-8MOFs处理的小鼠比neatFITC-BSAZIF-8MOFs处理的小鼠显著增加，还可以看出皮下免疫法比脚垫免疫法具有更好的靶向性(图5C)。这是因为与脚垫免疫法相比，皮下免疫法将材料分布在更大的表面积上，具有最小的回流，更小的解剖限制，以及减少局部炎症反应。在此基础上也研究了A10RNAaptamer-BSAZIF-8MOFs对前列腺癌细胞的靶向效率。注射9小时后，手术切除肿瘤和其他重要器官，进行体外荧光测量(图5D)。结果与anti-CCL21DNAaptamer-BSAZIF-8MOFs一致，A10RNAaptamer-BSAZIF-8MOFs处理的小鼠肿瘤的荧光强度高于neatFITC-BSAZIF-8MOFs处理的小鼠(图5E，F)。图5.Aptamer-FunctionalizedBSA
ZIF-8MOFs的体内评价。对aptamer-BSA
ZIF-8MOFs在体外(HUVEC细胞)和体内模型(BalB/c小鼠模型)的生物安全性进行测试。发现aptamer-BSAZIF-8即使在24小时最高暴露浓度下，MOFs对HUVEC细胞也没有任何潜在*性，说明在体外具有良好的生物安全性(图5E)。之后通过评估血清、肝肾功能生物标志物和重要器官的组织病理学，研究了aptamerBSAZIF-8MOFs在小鼠体内的生物安全性(图5A)。A10RNAaptamer-BSAZIF-8MOFs经尾静脉注射，anti-CCL21DNAaptamer-BSAZIF-8MOFs经皮下注射。在不同时间点采集血液和脏器(肝、肾、脾、肺、心)进行分析。和对照组相比，aptamer-BSAZIF-8MOFs没有明显的组织病理学变化(图5D)。总的来说，aptamer-BSAZIF-8MOFs在体外和体内模型中均表现出良好的生物安全性。图6.Aptamer-BSA
ZIF-8MOFs的生物安全。总之，作者探索了一种微流控方法，通过一步单芯片工艺快速制备核酸适配体功能化的BioZIF-8MOFs。微流控技术使我们能够封装多种生物分子，如核酸、蛋白质和小药物分子，并同时用核酸适配体(DNA和RNA适配体)使BioZIF-8MOFs功能化。与单纯的BioZIF-8MOFs相比，aptamer-BioZIF-8MOFs对淋巴结和肿瘤具有更高的靶向效率，*性可以忽略不计。因此，该工作阐明了一种简单的一步单芯片微流控制备表面功能化BioZIF-8MOFs的方法，用于靶向递送生物分子。
论文链接：