对于肿瘤转移到特定器官是否会通过损害全身抗肿瘤免疫和限制免疫治疗疗效而导致癌症死亡率提升，当前还知之甚少。肝脏作为癌症转移的常见部位，在自身免疫性疾病、病*感染和器官移植等情况下，也可以促进免疫耐受的发生。其机制包括无效免疫突触导致的T细胞失能，调节性T细胞增多或效应T细胞的缺失。然而，在癌症背景下，这些肝脏免疫耐受机制的重要性还没有被阐明。
免疫疗法利用肿瘤浸润的CD8+T细胞在多种癌症中诱导持久的免疫治疗效果，先前的研究已经明确了肿瘤导致局部T细胞功能障碍的反应和抵抗机制。但肿瘤发生时CD8+T细胞经常全身缺失的原因依然没有找到。
简介该研究发现，肿瘤肝转移的存在与癌症患者对免疫治疗的不良疗效有关。在小鼠中，肝转移可以通过募集免疫抑制的巨噬细胞到肝脏内从而促进抗原特异性T细胞的凋亡，进而导致全身T细胞的丢失和免疫治疗效果的降低。
放疗可以增强患者的免疫治疗效果。但此前并不清楚放射治疗应针对哪些转移部位，才能配合免疫治疗使免疫刺激作用最大化。针对这一问题，该研究证明，在肝转移模型中，肝脏定向放射治疗重塑了肝脏免疫微环境，阻止了T细胞被募集到肝脏中并恢复了免疫治疗的疗效，是定向放疗的良好靶标。
实验思路研究结果（1）肝转移与癌症患者免疫治疗效果降低相关
研究团队通过对接受免疫治疗和靶向治疗的两组转移性黑色素瘤患者进行调查，发现肝转移与免疫治疗反应减弱有关(图1a)，但与靶向治疗的效果无关。并且在接受免疫治疗的黑色素瘤患者中，肝转移与总生存期(OS)和无进展生存期(PFS)的降低相关(图1b)，接受靶向治疗的黑色素瘤患者的治疗效果却不会受到肝转移的影响。
为了证实这些结果，研究团队对接受免疫治疗或化疗的两组非小细胞肺癌(NSCLC)患者进行了调查。发现肝转移的患者免疫治疗效果较差(图1c)，而化疗的效果则与肝转移无关。这就导致接受免疫治疗后，伴有肝转移的非小细胞肺癌(NSCLC)患者的总生存期较低(图1d)。同样，对黑色素瘤和非小细胞肺癌患者的多变量建模也证实，存在肝转移时，转移性黑色素瘤和非小细胞肺癌的PFS和OS较低（图1e）。
基于随机森林的机器学习模型证明，和肿瘤负荷、LDH和PD-L1水平一样，肝转移也是与治疗功效相关的一个重要因素(图1f）。在一组具有相同水平PD-L1表达、肿瘤负荷和肿瘤突变且接受了免疫治疗的患者中，有肝转移的患者(图1g-i)的OS低于无肝转移的患者(图1j)，而对接受免疫治疗的黑色素瘤患者全身肿瘤负荷情况的定性和定量评估显示，有肝转移的患者比没有肝转移的患者更容易增加全身肿瘤负荷(图1k,l)。此外，在免疫治疗失败的肝转移患者中，观察到有84%的患者伴有全身其他器官的肿瘤进行性生长(图1m)。
随后，研究人员对名接受了免疫治疗的转移性黑色素瘤、非小细胞肺癌、尿路上皮癌和肾细胞癌患者进行了队列研究，发现无论疾病的组织类型如何，肝转移患者从免疫治疗中获得的治疗效果明显减少(图1n)。
图1
肝转移与癌症患者免疫治疗效果降低相关
（2）肝转移会降低小鼠的免疫治疗效果
为了进一步探讨肝转移对癌症患者免疫治疗的影响，研究团队建立了肝转移的临床前模型。正如预期的那样，携带皮下MC38（结直肠癌）肿瘤的小鼠对抗PD-L1治疗有效果，而肝转移小鼠的皮下肿瘤和肝肿瘤均对免疫治疗无反应(图2a–f)。通过给小鼠接种额外的皮下肿瘤控制肿瘤负荷，则观察到免疫治疗对多发性皮下肿瘤小鼠有效果，但对肝转移小鼠仍然无效(图2g,h)，而与肝转移的小鼠相比(图2i)，肺转移的小鼠对免疫治疗仍有反应(图2j)。
接下来，研究团队建立了皮下和肝脏的MC38肿瘤及B16F10（黑色素瘤）肿瘤的小鼠模型，发现当小鼠肝脏中的肿瘤和皮下的肿瘤是不同类型时，免疫治疗仍有效果，但当小鼠肝脏中的肿瘤和皮下的肿瘤是同一类型时，免疫治疗则没有效果(图2k-n)。
图2
肝转移会降低小鼠的免疫治疗效果
（3）肝转移引起抗原特异性T细胞的全身性缺失
接下来研究团队尝试确定肝转移影响免疫治疗的机制。与之前的研究结果一致，在只发生皮下MC38肿瘤的小鼠中，抗PD-L1治疗增加了肿瘤CD8+T细胞的浸润。相反，在皮下和肝都有肿瘤的小鼠中，皮下MC38肿瘤的T细胞浸润水平则十分有限(图3a,b)。
肿瘤引流淋巴结(dLN)中的T细胞启动是发展抗肿瘤免疫的第一步。研究发现，无论是否存在肝转移，PD-L1阻断引发皮下肿瘤dLN中CD8+T细胞激活的水平都是相同的(图3c,d)，而且肝转移也没有改变皮下肿瘤dLNs中OT-I肿瘤特异性T细胞的激活(图3e,f)或增殖(图3g)。这些数据表明肝转移并不会改变原始T细胞的启动和激活。
为了探究肝转移是否会影响T细胞在全身的分布情况，研究人员检测了皮下和肝脏荷瘤小鼠全身KSP-tetramer+CD8+T细胞的分布情况(图3h），发现肝转移不仅减少了皮下肿瘤中ksp-tetramer+CD8+T细胞的数量，也减少了皮下肿瘤dLN、未受累颈部淋巴结和外周血中ksp-tetramer+CD8+T细胞的数量(图3i)。相比之下，ksp-tetramer+CD8+T细胞在肝转移小鼠的肝脏中数量则相对升高的(图3i)。
向皮下MC38-OVA/肝脏MC38-OVA的小鼠和皮下MC38-OVA/肝脏MC38-luc的小鼠体内注射已激活的OT-I细胞(图3j)，则可以发现肝脏和肿瘤dLN中T细胞在早期呈积累状态，而到了晚期，肝脏表达OVA的肝转移小鼠则出现了系统性的T细胞缺失(图3k)。同时，肝转移患者的ALC（绝对淋巴细胞计数）也出现减少的现象，其他类型的细胞则没有变化（图3l）。
此外，研究还发现乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌、黑色素瘤或非小细胞肺癌伴肝转移的患者肿瘤内T细胞克隆减少，T细胞多样性减少(图3m,n)。
图3
肝转移引起抗原特异性T细胞的全身损失
（4）肝脏髓系细胞通过Fas-FasL通路诱导活化的T细胞凋亡
随后，研究团队开始探索肝内T细胞的命运，首先，研究发现CD8+T细胞在肝脏肿瘤小鼠中发生凋亡的频率显著增加(图4a)。将活化的OT-I细胞输入到有MC38-luc或MC38-OVA肝肿瘤的小鼠中后观察到，在肝转移表达OVA的情况下，OT-I细胞选择性凋亡频率增加(图4b)。
为了明确肝转移诱导T细胞凋亡的机制，研究人员采用了CyTOF技术来表征有肝肿瘤的小鼠和无肝肿瘤的小鼠在T细胞丢失前的肝脏免疫微环境(图4c,d)，发现伴有肝转移的小鼠CD11b+F4/80+髓系细胞比例增加，CD4+T细胞减少，但其他细胞类型比例相似(图4c,d)。据此可以推测，肝脏CD11b+F4/80+髓系细胞的增多(图4e)可能有助于肝转移的小鼠的免疫治疗耐药性。研究还发现，使用低剂量的氯膦酸盐和抗CSF-1单克隆抗体处理肝转移小鼠能够有效减少肝脏中髓系细胞的数量和肝内抗原特异性T细胞的凋亡（图4f）。这在很大程度上恢复了肝转移小鼠体内肿瘤特异性OT-I细胞的数量(图4g)，并系统性恢复了抗PD-L1治疗效果(图4h)。
为了确定肝脏的髓系细胞是否直接影响活化的T细胞凋亡，研究人员从肝肿瘤中分离出F4/80+细胞，与MC38-OVA和激活的OT-I细胞共培养。发现在表达OVA的肿瘤细胞存在时，肿瘤驯化的F4/80+细胞能够诱导OT-I细胞凋亡(图4i)。相反，正常肝脏和肺中的F4/80+髓系细胞只能介导有限的CD8+T细胞凋亡(图4i)。此外，髓系细胞可能是以细胞接触依赖的方式调控T细胞凋亡，因为只有当T细胞和F4/80+细胞直接接触时才能观察到T细胞凋亡(图4j)。
肝转移小鼠的肝内CD11b+F4/80+的髓系细胞表达高水平的FasL(图4k),而肿瘤特异性T细胞,无论是外源输入的OT-I细胞还是内源性KSP-tetramer+CD8+的T细胞,都高表达Fas，且阻断FasL后能够显著减少肝髓系细胞诱导的OT-I细胞凋亡(图4l)。
图4
肝髓系细胞通过Fas-FasL通路诱导活化的T细胞凋亡
（5）肝转移改变肝脏免疫微环境
为了进一步表征肝肿瘤免疫微环境，研究人员从有肝肿瘤和没有肝肿瘤的小鼠中分离肝的单个细胞并进行了单细胞测序。发现有肝转移的小鼠巨噬细胞亚群的细胞比例增加，T细胞亚群的细胞比例减少(图5a,b)。此外，有肝肿瘤的小鼠相比没有肝肿瘤的小鼠，活化的T细胞更多富集凋亡基因的特征。同时，表达Itgam(编码CD11b的基因)和Adgre1(编码F4/80的基因)也表达了经典的巨噬细胞标志物，包括Lyz2、Cd68和Lgal3(图5c)。
研究人员在正常肝脏和荷瘤肝脏，共发现有两种类型的肝巨噬细胞:一种是Timd4+Vsig4+Clec4f+的常驻巨噬细胞，另一种是Ccr2+的单核细胞来源的巨噬细胞(图5d)。采用流式细胞术的方法，发现在肝转移小鼠中，单核细胞来源的巨噬细胞的比例显著增加(图5f)。而且肝脏肿瘤的存在使得单核细胞来源的巨噬细胞与组织驻留的巨噬细胞相比，抑制性m2型巨噬细胞基因特征的评分上升，炎性m1型巨噬细胞基因特征的评分下降(图5g)。
在功能上，单核细胞来源的巨噬细胞比组织驻留的巨噬细胞表现出更高的交叉呈递基因特征。通过UMAP聚类对单核细胞来源的巨噬细胞进行了更深层次的表征(图5h)，通过伪时序分析确定了12个独特的细胞亚群(图5i)，以及具有4个分支的8种不同的细胞状态(图5i)。这些数据都表明，肝转移通过招募和极化单核细胞来源的巨噬细胞改变了肝脏的免疫微环境。
图5
肝转移改变肝脏免疫微环境
（6）放疗重塑肝脏免疫微环境
放射治疗在临床上可以控制肝脏肿瘤的发生发展，且可以刺激抗肿瘤免疫。研究人员推测肝脏定向辐射可调节肝肿瘤微环境，促进T细胞免疫，因此构建了皮下MC38肿瘤和肝脏肿瘤小鼠，并对其进行肝脏定向放疗、抗PD-L1治疗或二者联合的治疗。发现放疗增加了肝T细胞浸润，减少了肝髓系细胞数量，降低了CD11b+F4/80+的髓系细胞与CD8+T细胞的比例，而联合治疗还可增多肝脏中Ki67+IFN-γ+颗粒酶B+的CD8T细胞。这些数据表明，肝脏定向放射治疗可以同时钝化免疫抑制的髓系细胞和刺激肝脏中的T细胞免疫。
接下来，研究人员对肝脏定向放射治疗后肝脏内的先天和适应性趋化因子进行了无偏倚量化。发现放疗会导致CCL2、CCL11和CXCL2减少（可能促进髓系细胞的肝脏运输），同时导致CCL5和CXCL10增加（可能支持效应T细胞迁移到肝脏）。据此可以认为，放疗可通过改变肝内细胞因子环境来减少肝内的髓系细胞。此外，放疗还会导致体外肿瘤细胞CCL5和CXCL10以及MHC-I(H-2Kb)和PD-L1的表达量增加。
随后，研究人员评估了肝定向放射治疗是否会改善肝肿瘤微环境中的T细胞的生存环境。发现放疗后肝内抗原特异性T细胞凋亡减少（图6d)，全身OT-I细胞数量恢复(图6e)。这些数据进一步证明了放疗可以增加肝脏T细胞招募和存活率的观点。
图6a-e
放疗重塑肝脏免疫微环境
（7）放疗可消除肝转移引起的免疫治疗耐药性
为了评估肝脏放射治疗是否会整体改变抗肿瘤免疫的效果，研究人员采用了放射治疗、抗PD-L1或二者联合的治疗手段处理小鼠皮下MC38肿瘤和肝脏肿瘤。发现放疗明显增强了皮下肿瘤dLN中CD8+和CD4+T细胞的增殖和IFN-γ的产生。在接受联合治疗的小鼠中，这一结果更加明显。而与之前的数据一致的是，抗PD-L1治疗并没有增加肝转移小鼠皮下肿瘤中的T细胞数量(图6f,g)。虽然肝脏定向放疗本身并不能调节皮下肿瘤中的T细胞数量，但联合治疗显著增加了T细胞对皮下肿瘤的浸润(图6f,g)。同样，接受联合治疗的小鼠，肝脏和皮下肿瘤均有消退，生存期显著延长(图6h-k)。而去除联合治疗的小鼠中CD8+T细胞则完全消除了联合治疗的抗肿瘤作用(图6l)。此外，仅有皮下肿瘤的小鼠进行肝脏定向放射治疗也并不能调节抗PD-L1治疗的效果。这些数据表明，肝脏定向放射治疗以CD8+T细胞依赖的方式恢复免疫检查点封锁的全身疗效。
将此发现扩展到胰腺腺癌模型。发现与MC38（结肠癌）和B16F10（黑色素瘤）模型类似，携带皮下胰腺KPC2肿瘤的小鼠对抗PD-L1治疗有效果，而携带皮下和肝转移肿瘤的小鼠则均无治疗效果。同样，肝脏放射治疗恢复了皮下肿瘤对抗PD-L1的治疗效果，并减轻了肝脏肿瘤负荷。这些数据表明肝转移损害了免疫治疗的疗效，而肝放射治疗可能提供了一种消除这种耐药性的方法。
图6f-l
放疗消除肝转移引起的免疫治疗耐药性
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总结与展望
该研究证明肝转移可以募集并清除抗原特异性CD8+T细胞，导致全身免疫抑制，为人类癌症免疫缺失的病因学提供了新的见解。同时，该研究还证实，放射治疗可以重塑肝脏肿瘤的微环境，从而防止抗原特异性T细胞丢失。肝转移作为免疫治疗反应的一个潜在的负面因素，值得进一步的研究和探索。
THANKYOU文献分享者：高承智
原文引用：
doi:10./s---x
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