汇报人：LuYinLab研究生一年级王飞辉
这是德国汉堡-埃本多夫大学分子免疫学和胃肠病学研究室的研究人员发表在Gastroenterology上的一篇有关于IL22BP与结直肠癌最新研究进展的文章，IF:17.。
研究背景
在肠内，IL22促进肠干细胞介导的上皮再生，从而促进肠的完整性，还能保护肠干细胞免受基因*性应激的伤害。然而，当IL22活性不受控制且持续时间过长会促进肠道肿瘤的发生。研究显示IL22在人类结肠癌（colorectalCancer，CRC）中高表达，并与化疗耐药状态相关。
基于这些数据，IL22被认为是结肠直肠癌(ColorectalCancer，CRC)的潜在治疗靶点。然而，使用IL22的系统性阻断作为治疗策略可能会有严重的副作用，因为如上所述IL22也有有益的作用。因此，识别一种生物标志物来选择可能从IL22阻滞中受益的患者将是很重要的。
人体内存在一种由树突状细胞(DCs)、T细胞和嗜酸性粒细胞产生的，可溶性的IL22受体——IL22结合蛋白(IL22BP，IL22RA2)。它能与IL22结合，通过禁止IL22与膜上的IL22R1结合，从而限制IL22的生物利用度。因此，该课题组提出了科学问题，IL22BP的改变是否与人类和小鼠的结直肠癌发生有关？
研究结果
01
结果一CRC中IL22BP下调，并与淋巴*素表达相关
研究者首先使用qPCR技术分析了IL22、IL22R1和IL22BP在CRC患者健康黏膜和肿瘤组织中的mRNA水平，结果发现与健康黏膜组织相比，肿瘤中IL22水平升高，各组间IL22R1水平无差异，但CRC中IL22BP水平显著降低(图1a)。以上结果提示肠道恶性肿瘤中IL22-IL22BP轴的失调可能导致IL22活性升高。
此外，研究者还使用流式细胞技术分析CD4+T细胞中IL17A,IL22,IFNγ和TNFα蛋白水平的变化，结果发现与健康组织相比，肿瘤中IL22和相关细胞因子IL17A水平升高，IL22R1和IL22BP蛋白表达水平与上述结果一致(图1b-c)。
接着，研究者使用流式细胞术分析了IL22BP在不同免疫细胞中的表达情况，结果发现树突状细胞(dendriticcell,DCs)和嗜酸性粒细胞(eosnophil,EOS)是IL22BP的主要来源，而在CRC的肠道T细胞中只发现了少量表达(图1d-f)。值得注意的是，与CRC患者的正常邻近粘膜相比，肿瘤组织中DCs、EOS和CD4+T细胞中IL22BP表达降低(图1d-f)。然而，与CRC患者的正常邻近粘膜相比，肿瘤组织中DCs、EOS和CD4+T细胞的总细胞数并未减少。这些数据表明，CRC中IL22BP表达的降低是由于这些细胞产生的产物受损。
接下来，研究者假设IL22-IL22BP轴的不平衡是由肿瘤内细胞因子环境改变引起的。因此，研究者选择了已表明对IL22或IL22BP调控有重要作用的细胞因子TNFα、LTA、LTB、IL17A、IL23、TGFβ、IL22RA1与IL22BP的表达进行了关联分析(图1g-h)。图1g是CRC患者正常组织和肿瘤中几种基因的相关性矩阵，结果表明TNF-α、LTA、LTB的表达与IL22BP呈正相关。图1hCRC患者LTA、LTB表达与IL22BP的相关性研究和图1iLTA和LTB在肿瘤和大肠癌患者手术切除粘膜中的相对mRNA水平(n=99)，结果与相关性矩阵一致。
综上所述，研究者证明了IL22BP在人类CRC中的表达下调。此外，IL22BP与TNF超家族成员，即TNFα、LTA和LTB的表达相关。
02
结果二淋巴*素调控IL22BP的表达
研究者下一步的目的是研究TNFα、LTA和LTB是否可能调节IL22BP的表达。为此，研究者首先在稳定条件下测量野生型(WT)、Tnf-/-、Lta-/-和Ltb-/-小鼠结肠中IL22BPmRNA水平。结果发现，Lta-/-和Ltb-/-小鼠结肠中IL22BPmRNA水平显著下调，而Tnf-/-小鼠则没有(图2a)，这表明淋巴*素和IL22BP之间存在联系。
由于Lta-/-和Ltb-/-小鼠的免疫系统发育不全，研究者接下来的目的是验证IL22BP的下调不仅仅是广泛的黏膜免疫受损的结果。因此，研究者对WT小鼠使用激动性抗体(ACH6)或拮抗淋巴*素受体(LTBR)的FC-融合蛋白(aLTBR)。结果发现LTBR阻断显著降低了结肠、肠系膜淋巴结和脾脏中IL22BP的表达。然而，激动性抗体没有显著效果(图2b-c)。重要的是，之前被证明可以调节IL22BP的其他细胞因子的水平，如TNFα和IL18，不受aLTBR处理的影响，因此不支持由这些分子介导的二次效应(图2c)。
由于LTBR激动性抗体在稳定状态下不影响IL22BP的水平，研究者推测这可能与体内平衡时已经高剂量的IL22BP和淋巴*素有关。为了验证这一假设，研究者分析了葡聚糖硫酸钠(DSS)所致急性结肠炎小鼠模型中IL22BP下调时激动性抗体的作用。结果表明，疾病高峰期的IL22BP下调，IL22上调((图2f)。此外，LTB的表达曲线与IL22BP相似，提示淋巴*素可能在DSS-结肠炎中调节IL22BP(图2f)。最后，结果证明了激动性LTBR可以部分逆转IL22BP表达(图2f)。与此同时，研究者还发现，接受激动抗体的WT小鼠的疾病显著增强(图2d-f)，且这种疾病的差异依赖于IL22BP，因为在IL22BP-/-小鼠中没有观察到影响(图2d-e)。这些数据表明LTBR激动性抗体在稳定状态下不影响IL22BP的水平，与体内平衡时已经高剂量的IL22BP和淋巴*素有关。
接下来，研究者的目的是测试LTBR信号是否也会影响IL22的表达。有报道显示IL22通过LTBR-IL23轴在小鼠牙本质C.感染中发挥调节作用。因此，研究者利用鼠柠檬酸杆菌感染模型研究淋巴*素在IL22-IL22BP轴上的作用。结果发现给予激动性LTBR抗体的小鼠结肠中IL23和IL22上调(补充图S8)。此外，LTBR激动性抗体也可以诱导IL22bp的表达，与DSS-结肠炎实验中观察到的效果类似(图2)。然而，在稳态条件和DSS-结肠炎中，研究者并没有发现LTBR激动或阻滞对IL22水平的影响(图2f，补充图S7)。
综上所述，研究者发现淋巴*素在稳定和炎症状态下都能调节结肠中IL22BP的表达。
03
结果三IL22BP在小鼠中介导淋巴*素的抗肿瘤作用
接下来，研究者的目的是确定淋巴*素-IL22BP轴是否在肠道肿瘤发生中起作用。为此，研究者在结肠癌模型的WT和IL22BP-/-小鼠中阻断了LTBR。研究者使用的是成熟的AOM/DSS模型，在该模型中，注入诱变剂(AOM)后，DSS诱导的肠道炎症重复循环。DSS给药3周期后，用小鼠结肠镜检查肿瘤负荷(图3a、b)。研究结果与之前一致，在稳态条件下，阻断LTBR可以降低肿瘤组织中的IL22BP水平(图3c)。此外，抑制LTBR可显著增加WT小鼠肿瘤数量和肿瘤负荷，而对IL22BP-/-小鼠没有影响，表明淋巴*素的抗肿瘤生成效应在这个模型是IL22BP依赖的(图3a、b)。
接下来，研究者在第二个结肠癌模型中证实了淋巴*素的抗肿瘤作用。在该模型中，小鼠接受剖腹手术，并将表达荧光素酶的MC38结肠癌细胞注射到WT小鼠的盲肠。注射后，通过检测盲肠肿瘤的生物发光来追踪肿瘤的生长。值得注意的是，淋巴*素在该模型中的作用也取决于IL22BP在IL22BP缺陷小鼠中的存在(图3d,e)。总的来说，结果表明，淋巴*素在结肠癌小鼠模型中的抗肿瘤作用是IL22BP依赖的。
通过上述研究，已确定淋巴*素是CRC中IL22BP的关键调节器，研究者下一步的目标是确定淋巴*素的来源。为此，研究者对浸润CRC的免疫细胞进行了单细胞RNA测序(图4a-c)。结果发现LTB主要由CD4+T细胞、B细胞和NKT细胞表达(图4bc)。LTA转录本仅在少数细胞中检测到，因此，无法根据单细胞测序准确评估LTA的细胞来源。
为确定淋巴*素在IL22BP调控中的功能相关来源,研究者测量了RorcCreLtaflox/flox小鼠(其中所有已经表达Rorc的细胞，包括T细胞，不产生LTA)和Cd19CreLtaflox/flox小鼠(B细胞不能产生LTA)结肠中IL22BP的表达。有趣的是，在RorcCreLtaflox/flox小鼠中IL22BP的表达降低了，而在Cd19CreLtaflox/flox小鼠中，我们发现IL22BP的表达有增加趋势，但无显著差异(图4d)。这些数据表明，T细胞来源的淋巴*素（而不是B细胞来源的淋巴*素）在调节IL22BP在结肠中的表达中起关键作用。
04
结果四淋巴*素通过非经典NF-κB通路调控IL22BP的表达
接下来，研究者的目的是确定淋巴*素对IL22BP表达的影响是否直接或间接由LTBR介导。为此，研究者采用了一种基于人类单核细胞来源的树突状细胞(MDDCs)的检测方法，该方法可以产生高水平的IL22BP。的确，MDDCs暴露于LTα1β2或针对人类LTBR的激动性抗体，经流式细胞术分析可导致IL22BPmRNA和蛋白水平的升高(图5a-c)，表明LTBR信号通路对IL22BP的产生有直接影响。
因为LTBR信号能够激活经典和非经典NF-κB通路,研究者假设NF-κB信号是淋巴*素诱发IL22BP的可能机制。研究者使用WesternBlot确认MDDCs接触LTα1β2后会激活RelA(经典NF-κB通路的一部分)和RelB（非经典NF-κB通路)(图5d-f)。基于NF-κB激活和IL22BP生成之间的正相关关系，研究者假设淋巴*素可能通过激活NF-κB来调节IL22BP。为了验证这个假设，研究者采用shRNA敲低了RelA和RelB(补充图S10)。研究者通过流式细胞术和WB发现敲低RelB可导致IL22BP水平降低，敲低RelA对IL22BP没有显著影响(图5g-i)。这些结果补充证明了先前的发现，表明TNFα对于DCs中IL22BP的表达水平没有影响，因为TNFα信号激活的是经典NF-κB信号通路，而不是非经典NF-κB信号通路。因此，研究者得出结论:在人类DCs中，IL22BP是由LTα1β2通过非经典NF-κB信号通路诱导生成的。
05
结果五IL22BP水平与CRC患者预后相关
最后，研究者采用临床样本确定淋巴*素和IL22BP水平的降低的临床意义。为此，研究者比较了92例患者的生存率，其中46例IL22BP高表达患者和46例IL22BP低表达患者(图6a)。以中位IL22BP表达水平作为截断值，通过多因素分析，研究者发现IL22BPmRNA水平高的患者预后明显更好(发现数据集，表S2)(图6b,6d)。该分析的还提示IL22BP表达较低的患者肿瘤分期较晚期(图6c)。
具体来说，IL22BP低表达水平的样本在淋巴结受累或远处转移的患者中多见。因此，研究者在另一个更大的芯片中检测了例CRC患者的IL22BP水平(验证数据集，表1)。为此，研究者在石蜡包埋的组织芯片中对IL22BP进行了免疫组化染色(图6a,6e)。根据染色结果将患者分为两组，其中1组(例)检测到IL22BP蛋白，另1组(例)检测不到IL22BP蛋白(图6e)。多变量分析的结果证实了初步研究结果，即肿瘤中IL22BP高表达的患者有更好的临床预后(图6f-h)。最后，研究者使用癌症基因组图谱(TCGA)对其他胃肠道/粘膜肿瘤进行了类似的分析。有趣的是，在结直肠癌中IL22BP的高表达与较好的预后显著相关，但在其他恶性肿瘤中则没有，这表明这种作用可能针对CRC(补充图S12)。
综上所述，IL22BP低表达是降低生存率的独立危险因素，提示IL22BP是CRC患者重要的预后生物标志物。
文章主旨总结
研究人员发现IL22BP在人CRC中下调，说明IL22在该恶性肿瘤中的调控受损。根据这些数据，研究人员发现IL22BP低表达是CRC患者低生存率的独立危险因素。此外,还发现在树突状细胞中IL22BP生成是由淋巴*素(LTα1β2)通过非经典NF-κB通路来调控的。最后，通过CRC小鼠模型，研究证明了IL22BP联合淋巴*素的抗肿瘤作用。因此，IL22BP低表达的结直肠肿瘤患者可能受益于IL22拮抗剂的治疗。
个人观点
该研究由IL22作为潜在的结直肠癌治疗靶点入手，研究了人体内IL22受体-IL22结合蛋白(IL22BP）在人类CRC中的来源、意义以及诱导途径。作者由浅入深，层层推进，深挖出了IL22BP在人类CRC中的来源、意义以及诱导途径，逻辑严密，思维严谨。此外，运用多种结直肠癌模型对实验结果进行了重复验证，使之更具说服力。此外，在关于IL22BP来源的研究者中，应用了基因敲除技术合理设计了实验验证，说服力较强。最后，该研究结合大量临床样本，使得研究结果更具说服力，对于临床治疗结直肠癌也具有十分重要的指导意义。
但个人对于文章中仍存在一些疑问，如结果二中利用鼠柠檬酸杆菌感染模型研究LTBR信号对IL22表达的影响，研究结果与稳态条件和DSS-结肠炎模型中结果并不一致，作者未作进一步地说明。
导师:王爱云
稿件编辑：宗港凡
稿件审阅：小菜圆
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