在转移过程中，恶性肿瘤细胞先是逃离原始肿瘤，入侵淋巴管，然后抵达前哨淋巴结，之后通过血液循环定植在远处器官。虽然在癌症患者中，淋巴结转移往往提示不良的预后，但是，肿瘤细胞是否以及如何通过淋巴结进入血流的，仍旧缺乏有力的证据。今天，为大家带来一篇3月发表在science上的一篇文章，题为《Lymphnodebloodvesselsprovideexitroutesformetastatictumorcelldisseminationinmice》，即“淋巴结血管为转移性肿瘤细胞的转移提供路线”。为了深入了解淋巴结内的肿瘤细胞是如何利用淋巴结进入血液循环的，作者通过细胞微量注射的方法将癌症细胞经输入淋巴管送入小鼠的淋巴结，从而建立一个小鼠模型。作者发现，肿瘤细胞会快速浸润淋巴结实质并入侵淋巴结血管，而不经胸导管便发生了肺转移。这些结果提示，在该实验小鼠模型中，淋巴结血管能作为癌细胞全身转移的途径。这种肿瘤细胞转移形式是否也发生在癌症患者中尚不能肯定。
淋巴结作为循环免疫细胞的交流站，其重要性不得而知。肿瘤细胞也能利用淋巴结进行远处转移。虽然，无论是小鼠模型还是肿瘤患者上所进行的多个研究都支持这个结论，但是，淋巴结转移和外周转移之间的因果关系还未确立。那么，淋巴结是如何充当全身转移的路线？肿瘤细胞又是如何抵达血液循环？是通过输出淋巴管，更高一级的淋巴结或胸导管，还是直接经由淋巴结血管？为了深入这个问题，作者采用了淋巴内微量注射将精确数量的鼠源的4T1乳腺癌细胞注入小鼠腘窝淋巴结的被膜下淋巴窦内。这种方法允许在原发肿瘤不存在的情况下，对肿瘤转移在淋巴结内及之后肺转移过程中发生的最早期一些步骤进行精确的分析，作者将这种人为造成的淋巴结转移称为“实验性淋巴结转移灶（experimentalLNMetastases,ELMs）”。这种微量注射纪要保持淋巴结内的细微结构，也不能影响淋巴结间质骨干的生理性溶质过滤功能，并且不改变注入白细胞的经典迁移路径。注入的物质也不能漏入下游的髂骨内测淋巴结或者肺中。
4T1肿瘤细胞淋巴内注射后观察淋巴结，发现这些细胞最初聚集在被膜下淋巴窦内（Fig.1A）。1天内，肿瘤细胞越过被膜下窦的基底部，在接下来的3天，肿瘤细胞沿着淋巴结间质网络向淋巴结中心进展（Fig.1）。将来自人乳腺癌患者的带肿瘤的前哨淋巴结样本与其进行比较发现，ELMs的组织学图像和人体病理极其相似。乳腺癌的侵袭性和基底细胞标志物分子的表达有关，例如p63和细胞角蛋白14（CK14）。因为无血管被膜下淋巴窦内的肿瘤细胞需要快速抵达实质血液供给处以求生存，作者猜想淋巴内注射后，肿瘤细胞的侵袭性标志物在早期上调。确实，注射2天后，和原位注射或常规培养的4T1细胞相比，CD14表达在这些4T1肿瘤细胞中显著升高。在注射3天后，当肿瘤细胞已经进入深部淋巴结实质，平均的CK14水平已经恢复正常水平，剩余的CK14高表达细胞多定位在ELM的入侵边缘。综上，这些数据提示ELM可以作为研究淋巴结转移的一种有效模型。
Fig.1.淋巴内注射的4TA乳腺癌细胞浸润淋巴结
(A)淋巴内注射0、1、2、3天后4T1ELMs免疫荧光。红色，细胞角蛋白8（cytokeratin8，CK8）;蓝色，CD31;灰色，平滑肌肌动蛋白（smoothmuscleactin，SMA）。N=5EMLs
(B)淋巴内注射后第1天和第3天的图像放大后如图所示SMA+成纤维网状细胞
(C)在注射3天后4T1ELMs（n=5）区域的SMA+成纤维网状细胞网络所得肿瘤细胞间距离及计算机模拟等值面（ISSRD,insilico-simulatedequallydistributedisosurfaces）
(D)肿瘤瘤体原位移植或肿瘤细胞悬液淋巴内注射3天后4T1肿瘤的肿瘤细胞间距离n=5
(E)输注mCherry+4T1肿瘤细胞后1天和3天，荧光显微镜图像下淋巴结代表性分段
红色，mCherry+肿瘤细胞;*色，自发荧光包膜;绿色，外周淋巴结地址素（PNAd，peripheralnodeaddressin）阳性的HEVs;青色，Prox1+淋巴窦。
(F)淋巴内注射0、1、2、3天后，距被膜下窦所示距离的平均4T1肿瘤细胞数。n=5ELMs
侵袭性4T1细胞在注射2天后被发现与血管联系紧密（Fig.2A）。在第3天的时候，细胞包绕和侵入血管管腔（Fig.2B-D）。鉴于浸润区域内外相似的血管密度，肿瘤细胞和血管之间的紧密联系，并不是肿瘤细胞局部诱导的血管再生。淋巴结血管有特殊的毛细血管后段，称为“高内皮静脉（HEVs，highendothelialvenules）”，用来作为淋巴细胞的输入端。ELM样本的二维或三维形态学分析提示当进展至淋巴结中心时，肿瘤细胞逐渐变得与HEVs联系紧密并大量定位在HEVs管腔内（Fig.2C-E）。这些数据表明HEVs是肿瘤细胞进入血液循环的主要通道。在人乳腺癌患者淋巴结微小转移灶内观察到相似的肿瘤细胞-血管间联系和肿瘤细胞血管浸润。而且，体外粘附试验中在天然小鼠淋巴结切片上对4T1细胞进行培养，作者也观察到了肿瘤细胞和血管的共定位。
Fig.2.4T1肿瘤细胞贴近并入侵淋巴结血管
(A)淋巴内注射4T1肿瘤细胞2天后免疫荧光；箭头表示CD31+血管。插图是近距离显示肿瘤细胞-血管相互作用。
(B)注射3天后4T1ELMs图像
(C)B图方框内区域放大和连续剖面；上图箭头所示为血管腔内肿瘤细胞；下图所示为HEV腔内肿瘤细胞
(D)输注后0,1,2和3天，4T1ELM代表性荧光显微图像。红色，mCherry+肿瘤细胞;*色，自发荧光包膜;绿色，外周淋巴结地址素（PNAd，peripheralnodeaddressin）阳性的HEVs;青色，Prox1+淋巴窦。肿瘤细胞和HEVs相互作用以白色标注。
(E)输注0,1,2,3天后肿瘤细胞与HEVs联系，n≥6ELMs
为了研究肿瘤细胞和淋巴结血管之间的联系是否和全身转移的形成有关，我们用mCherry-和表达荧光的（mCherry+luciferase+）4T1淋巴细胞进行小鼠淋巴内注射，然后对小鼠进行全身活体生物发光成像。用荧光蛋白或荧光素酶进行基因标记不会影响细胞增殖和迁移。肿瘤细胞淋巴内注射35天后，肺部是唯一发生大转移灶的器官（Fig.3A）。这种转移种植模式和，将4T1肿瘤细胞原位注射到同基因小鼠、以及将MDA-MB—人类乳腺癌细胞淋巴内注射入免疫缺陷的小鼠中所观察到的相似。对分离的肺进行生物荧光成像显示，淋巴内注射4T1肿瘤细胞11天及21天后，肺内产生表达荧光的多灶性转移，显微镜下检查揭示早至注射后6及11天便有肿瘤细胞聚集成簇。这些数据表明ELMs快速地转移到外周组织。
为了确定肿瘤细胞最早转移到肺的时间点，作者淋巴内注射luciferase+mCherry+4T1细胞后，在第2或者第3天移除淋巴结（Fig.3C）。注射后11天进行观察。在第三天移除淋巴结的组内发现，33.3%的小鼠出现了肺转移，而第二天移除淋巴结组的小鼠都没有发现肺转移（Fig.3D）。这些结果支持先前发现的：肿瘤细胞在淋巴内注射3天后开始侵犯淋巴结血管（Fig.2B-E）。据此，在淋巴内注射带荧光4T1细胞3天后，作者又用流式细胞术对血液中的循环肿瘤细胞CTC进行检测（Fig.3E-F）。这些结果和先前普遍认为肿瘤淋巴结转移是通过输出淋巴管、更高一级的淋巴结、胸导管和锁骨下静脉作为路径的观点相悖。因此，作者又采用定量流式细胞术来研究mCherry+4T1ELMs肿瘤细胞定植到肺与髂内淋巴结（引流输注至腘窝淋巴结的ELM）的动力学（Fig.3G）。作者发现髂内淋巴结的肿瘤细胞数不能预测肺转移数。注射3天后，当转移肿瘤细胞在80%的经注射小鼠的肺内能被检测到时，髂内淋巴结没有肿瘤细胞。所有的髂内淋巴结在28天后才发生肿瘤细胞定植。表达mCherry的小鼠结肠癌细胞系CT26的ELMs表现出相似的结果：注射12天后，CT26细胞已经转移到83%小鼠的肺内，然而仅17%的小鼠在髂内淋巴结中发现肿瘤细胞。综上，这些结果表明ELMs早期发生的外周转移不可能是通过输出淋巴管进行的。为了通过实验设计阻断经输出淋巴管转移的这条路径，作者在注射前对输出淋巴管进行结扎。淋巴内注射染料不能抵达下游髂内淋巴结以及淋巴内注射的T细胞不能够再循环进入脾脏，说明输出淋巴管已被完全阻断。作者发现淋巴管结扎后，4T1肿瘤细胞仍能在注射后3天内转移到肺。基于这些结果，作者推测其实验小鼠模型中，淋巴结血管是淋巴结肿瘤细胞早期进入全身循环的一条途径。
Fig.3.ELMs转移到肺不依赖胸导管
(A和B)淋巴内注射mCherry+luciferase+4T1肿瘤细胞后双荧光成像
(A)注射3和35天后腘窝（楔形）和肺（箭头）n=12mice.
(B)注射后11和21天肺转移灶（楔形）n=5mice
(C)实验设计：0天，注射mCherry+luciferase+4T1肿瘤细胞；2天及3天，体内双荧光成像证实肿瘤生长，之后ELMs被切除。于11天对肺进行活体双荧光成像，再进行体外分析。
(D)转移阳性（Meta+）和转移阴性（Meta?）肺计数n=12mice
(E)注射3天后的5只小鼠进行循环mCherry+4T1肿瘤细胞流式细胞术分析
X轴，mCherry荧光强度；Y轴，前向散射。n=其中3只小鼠
(F)注射mCherry+4T1肿瘤细胞3天后流式分析所得平均循环肿瘤细胞计数±标准误
(G)注射至35天过程中髂内淋巴结和肺流式分析所得平均循环肿瘤细胞计数±标准误的变化图
文中实验设置确立了在缺少原始肿瘤的情况下ELMs对外周转移的作用。然而，有证据表明转移过程发生之前，先是肿瘤内和宿主微环境内进行调整，这两者在ELM模型中均被跳过了。为了模拟宿主体内转移前情况，作者通过接种未标记4T1细胞到踝上方侧跗骨区的方法，将一个外周肿瘤移植到小鼠上。8天后，淋巴内注射mCherry+luciferase+4T1肿瘤细胞诱导ELMs。这些实验表明淋巴结内ELMs在有外周肿瘤激发的情况下，与初始淋巴结内的ELMs具有相似的肺转移频率。无论有无初始肿瘤激发，转移同样不依赖胸导管途径。为了模拟肿瘤细胞可能发生了适应，作者又原位诱导mCherry+luciferase+4T1肿瘤定植于引流淋巴结。作者从这些淋巴结中取下肿瘤细胞，简短地再培养后重新注射入新宿主动物的腘窝淋巴结。在这样的条件下，83.3%的注射动物产生了肺转移，同样不依赖于胸导管。综上，这些结果证实经淋巴结血管的直接转移不是由于人为的淋巴内注射肿瘤细胞进入未激发的淋巴结环境诱导产生的。
作者建立了一个前哨淋巴结转移小鼠模型用以分析经淋巴结早期转移路径。作者发现早期肿瘤细胞附着和浸润淋巴结血管，与循环肿瘤细胞和肺转移的出现相一致。文中模型揭示了淋巴结血管是从淋巴进入全身循环的有效路径，比原始肿瘤直接发生转移更有效。文中数据和Pereira等人用不同小鼠模型方法学所得的结果相似。尽管文中基于如此一个简化小鼠模型的实验结果提示淋巴结是全身肿瘤细胞传播的有效交换站，未来仍需要临床和实验性研究来确定这些实验结果是否和人类肿瘤也相关。
今天的文峰聊CNS到这里就结束了，我们下期再见~
文献来源：