黑色素瘤的临床治疗面临着存活率低，复发率高等问题，约20%的患者在确诊为晚期后能够存活5年，而41%-55%的患者在治疗后复发。目前，免疫治疗被认为是治疗黑色素瘤最有希望的方法，主要包括重新激活T细胞抗肿瘤免疫反应。然而，只有10%-33%的患者表现出对免疫检查点阻断治疗策略的应答，通过对这些表现出免疫应答的患者研究发现，其生存率和抗肿瘤效应的提高主要与高表达颗粒酶和炎症因子的CD8+T细胞数量增加，以及肿瘤中免疫检查点和抗原刺激标记物PD1的表达量有关。CD8+T细胞中PD1与转录因子TCF1的表达量也是黑色素瘤的一个预后指标。因此，在肿瘤微环境（TME）中T细胞高数量和高质量的产生是诱导有效的抗肿瘤免疫的重要步骤，是扩大抗肿瘤免疫治疗效益的有效策略。
肿瘤特异性CD8+T细胞的生成依赖于抗原呈递细胞APC（包括树突状细胞和巨噬细胞）激活T细胞，诱导原始T细胞分化，促进T细胞功能化。为了促进T细胞对抗原的识别，淋巴结中APC的抗原呈递能力尤为重要，外周组织中的抗原通过淋巴管进入引流淋巴结（dLN），而淋巴囊下窦（一个由成纤维网状细胞和淋巴管内皮细胞组成的屏障）限制了APC的抗原获取和呈递。
在癌症发生过程中，肿瘤和dLN发生结构重塑，会对抗原敏感性以及由此产生的抗肿瘤免疫反应的大小和功能产生影响。TME局部免疫抑制已被广泛认为是癌症的标志，在肿瘤的发展和进展过程中持续不断地发生免疫抑制作用，TME中的T细胞活化受损，肿瘤相关DC显示高PD1配体和B7家族表达，免疫抑制的肿瘤相关巨噬细胞以及调节性T细胞和髓源性抑制细胞高度浸润TME。
黑色素瘤易发生淋巴转移，主要表现为较高的瘤周淋巴扩散。因此，TME中的免疫抑制途径可能会出现在下游的淋巴结中，这些肿瘤诱导的抑制细胞能够抑制DC介导的T细胞启动，同时淋巴结中的细胞成分也会发生重塑，例如SCS的成纤维网状细胞在黑色素瘤中表现出通透性和活性增加以及在TdLNs中观察到与肿瘤免疫抑制相关的TME的生物物理特征，而这些重构途径如何影响肿瘤源性抗原在TdLN内细胞间的分布，从而调节抗原特异性T细胞免疫的发展，目前尚不清楚。
本文作者巧妙地设计了一套纳米级生物材料来分析淋巴转运、细胞结合和抗原表达，以描述这些相互关联的过程对LNs内CD8+T细胞免疫产生的协同影响，包括评估大分子通过淋巴管传输到dLN内的示踪系统以及评估抗原呈递和T细胞对抗原感应的合成抗原系统。作者应用这一系统评估淋巴转运机制对dLN细胞的抗原可及性和表达的影响，评估抗原特异性CD8+T细胞池的功能，以及这些过程在肿瘤环境下是如何改变的。在黑色素瘤小鼠模型中，TdLNs内诱导的CD8+T细胞免疫被淋巴转运途径分隔，并在黑色素瘤小鼠中保持治疗功能。这些结果对如何利用TdLNs独特的微环境和抗原传感能力来改善黑色素瘤的免疫治疗策略提供了未知的见解。
1.LN内免疫细胞对经皮灌注大分子的运输屏障和调节机制
将一组荧光示踪剂注入幼年小鼠的皮肤中，分析给药不同时间后荧光示踪剂在dLNs的累积总量以及在驻留白细胞的分布情况。分别注射粒径为30和10nm的荧光标记的葡聚糖（分子量为和40kDa），以及粒径为nm的聚苯乙烯微球，比较给药后三种粒径大小的纳米粒从淋巴转运到dLN的程度，结果表明，在注射4h后，10nm和30nm的葡聚糖主要积聚在SCS内（图1A），并且在DLN的实质中观察到10nm示踪剂相对于30nm示踪剂的渗透深度增加（图1B），粒径为nm的聚苯乙烯微球与较小的葡聚糖示踪剂相比，在dLN的SCS内没有积聚，主要积聚在LN实质乳糜中（图1B，1C），呈现点状分布，并且这个过程发生得较为缓慢。与30nm葡聚糖（图1D）相比，10nm葡聚糖被更多的细胞摄取，这一结果与10nm葡聚糖能够更深入地穿透LN实质的能力相关。结合上述研究，作者进一步考察淋巴结中白细胞的分布特征，以及不同纳米粒示踪剂被不同白细胞亚型摄取的情况考察淋巴结的实质性结构对白细胞中示踪剂分布的影响，结果表明LN主要分布B细胞（B+dLN）、DC（CD11c+）和SCS（CD+）与T细胞（CD3+）（图1D），10nm示踪剂在B细胞中大量积累，这与它们在SCS内积累后进入LN导管的效率一致（图1F）,30nm示踪剂更局限于SCS，在更多的DC细胞中发现，而nm示踪剂主要位于皮肤移行细胞内，例如dDC和LCs。因此，淋巴转运和LN实质的结构性屏障会严重影响示踪剂在LN驻留白细胞的分布。
图1.流体力学大小调节LNs引流部位不同区域和细胞的生物分子通道
2.黑色素瘤诱导周围树突状细胞成熟，改变抗原呈递到淋巴结的机制
为了评估肿瘤对TdLNs内APCs的影响，在荷瘤小鼠的肿瘤和dLN中发现dDC和LCs的DEC+DC均表现出较高的CD86表达和较低的CD表达（图2A，B），表明黑色素瘤能够诱导肿瘤和dLN中皮肤来源的DC成熟并降低耐受性，对DC运输、吞噬和抗原呈递具有潜在影响。将nm示踪剂注射到荷瘤第7天的小鼠肿瘤内，发现示踪剂被转移到TdLNs（图2C），并且通过流式细胞术测量示踪剂荧光发现荷瘤小鼠dLN中示踪剂的积聚大于正常小鼠皮肤LNs中示踪剂的积聚（图2D,E），在评估的移行细胞中，dDC的示踪剂摄取量增加，而LCs的没有增加（图2D，F），这一结果可能与成熟的APC细胞趋向于迁移的能力有关。当以单个细胞为基础进行评估时，虽然在注射到荷瘤动物体内24h和72h后，所有CD45+细胞中nm示踪剂荧光强度均降低（图2G），并且不同细胞亚型中荧光强度也呈现下降趋势（图2H），但摄取细胞数量增加（图2E），这一现象可能是由于随着肿瘤诱导APC的成熟并发生迁移时，其吞噬能力降低，从而使每个细胞的抗原含量降低。由于APC成熟度、总迁移细胞数及其携带的有效荷载的改变会影响DLN内的抗原呈递，因此通过人工合成抗原（H-2Kb:OVA-）对动物进行抗原攻击。将合成抗原注射到小鼠的皮肤或肿瘤中，72h后考察抗原呈递效果，发现dLNs内呈递抗原的大多数细胞不包含nm的示踪剂（图2I）。对所有呈递H-2Kb:OVA-抗原的细胞分析发现，荷瘤小鼠淋巴转移的dDC和LCs以及LN常驻B细胞抗原呈递的数量增加，而cDC和pDCs的抗原呈递没有改变（图2J）。通过流式细胞术评估每个细胞抗原呈递的荧光强度，dDC在荷瘤小鼠肿瘤部位注射抗原的呈递量低于皮肤注射抗原的呈递量，但LCs和B细胞的抗原呈递数量没有变化（图2K），主要与CD8+T细胞有关，肿瘤源性抗原呈递给LN驻留的CD8+T细胞的数量增加，dDC将抗原转移给B细胞呈递（图2I,L），增强外周组织来源的抗原向dLN中的B细胞呈递。综上，由肿瘤引起的APC成熟和迁移的变化导致nm微球更容易进入TdLN细胞，并且增强了TdLN中dDC，LC和B细胞抗原呈递能力。
图2.APC从皮肤迁移到引流淋巴结
3.黑素瘤改变了淋巴结内淋巴来源的纳米制剂的摄取和DC细胞表型
在探讨疾病对淋巴引流淋巴结内抗原的累积和吸收的影响时，对比正常小鼠皮下注射和荷瘤小鼠瘤内注射30和10nm示踪剂72h后dLN的累积量，荷瘤小鼠的示踪剂累积量具有降低的趋势（图3A），但是TdLNs中B细胞和pDC的示踪剂水平在72h内仍然很高（图3B，3C）。对于pDC，其位于LN实质内距SCS更远的位置，因此不受淋巴通路的限制，并且与黑色素瘤的dLNs内LN纤维网状细胞导管的通透性增加相有关，这些结果表明，尽管疾病引起了淋巴引流改变，但TdLN重塑仍维持了淋巴引流溶质进入常驻白细胞的通路。
通过使用合成抗原纳米粒来评估TdLN细胞抗原呈递能力，其大小与葡聚糖类似（NP）（图3D），这些纳米粒通过间质，流入淋巴管，并在注射后以类似于荧光葡聚糖示踪物的方式在dLN内长时间聚集（图3E，F）。因此，通过H-2Kb:OVA-染色评价淋巴引流APC抗原交叉呈递，结果表明肿瘤内注射抗原并没有导致TdLNs内交叉呈递的总数量或单个细胞亚型的增加（图3G，H），H-2Kb:OVA-染色的平均细胞一昂光强度也没有改变（图3I），与DC耐受性相关的CD表达在肿瘤和TdLN的pDC以及肿瘤的cDC中增强（图3J，K）。结果表明，LN驻留的APC抗原的交叉呈递不受肿瘤的影响。这与MP（nm）抗原引起的抗原呈递趋势相反（图2A,B），进一步阐明了淋巴转运机制对肿瘤中T细胞抗原感知的特异性变化的影响。
图3.正常小鼠和荷瘤小鼠的被动淋巴引流
4.黑色素瘤dLN是增强肿瘤抗原特异性T细胞存活和抗原积聚的重要部位
黑色素瘤诱导的APC抗原呈递和表型的变化可能实质上影响T细胞对抗原的感知和反应。作者研究了在接种黑素瘤的小鼠在免疫微环境中由内源性肿瘤抗原产生的CD8+T细胞免疫。小鼠在接种表达OVA的B16F10黑色素瘤7d后，发现肿瘤和TdLNs中都高度富集肿瘤抗原（图4A，B）。将肿瘤抗原特异性（OT-1）CD45.2细胞转移到携带B16F10-OVA的CD45.1小鼠中72小时后，发现肿瘤和dLNs中细胞增殖，但NdLN或脾脏没有增殖（图4C）。增殖的OT-1供体细胞高度集中在TdLN中，但在其他分析组织中却没有（图4D）。与TdLNs内的细胞相比，在肿瘤内增殖的供体CD8+T细胞表现出较低或较差的生存能力（图4E，F）。与肿瘤，脾脏和非引流淋巴结（NdLNs）中测得的供体细胞相比，TdLNs中表达CD39的供体CD8+T细胞的数量也很高（图4G，H）。与肿瘤，脾脏和NdLN相比，TdLN中表达PD1的干细胞样亚型的供体CD8T细胞能够响应PD1的ICB治疗（图4I）。因此，与肿瘤和其他淋巴组织相比，TdLN能够增强肿瘤抗原特异性T细胞的增殖和存活，调节抗肿瘤免疫效应。
图4TdLN增强抗原特异性CD8+T细胞启动和存活
5.淋巴转运机制调节LN内的抗原呈递和T细胞响应
作者评估了从外周组织到dLNs淋巴转运的机制如何影响dLNs内的抗原特异性CD8+T细胞的反应（图5A，B），由于CD8+T细胞发生抗原响应进行程序性增殖，分别用NPs(30nm)和MPs(nm)进行抗原攻击3d后dLNs内响应T细胞的增殖程度是相同的（图5C）。但是，NP介导的抗原攻击导致维持高水平的CD8+dLN细胞，而MP攻击7天后CD8+T细胞数量减少（图5D）。与MP攻击相比，NP攻击导致dLN内的PD1+细胞数量更高（图5E，F）。MPs攻击3天后产生了更多的GzmB+和IFN-γ+供体细胞（图5G，H）。
这些结果表明，抗原感知和诱导功能性细胞*性CD8+T细胞在抗原转运至dLNs的机制之间是分隔开的。APC从淋巴运输到dLNs会诱导更多具有细胞*性功能的T细胞。但是，淋巴引流会导致dLNs的抗原总体水平更高，诱导PD1+细胞和更多干状CD8+T细胞的产生。
图5.抗原特异性CD8+T细胞对抗原的响应程度和数量取决于淋巴转运到dLN的机制
6.TdLN内CD8+T细胞的抗原诱导TME中具有治疗功能的抗肿瘤T细胞反应
TdLNs中响应于MP和NP的CD8+T细胞数量大致相等（图6A）。MP处理7天后导致PD1+和PD1+Tcf1+Tim3-CD8+T细胞数量增加（图6B），在TdLNs中，由MP引发CD8+T细胞能够直接杀死肿瘤细胞（图6C）。与对照组的肿瘤相比，治疗7天后TME中TdLN的减少与GzmB+CD8+T细胞的大量增加有关（图6D）,此外，发现约有20％至30％的肿瘤浸润CD8+供体细胞对MP或NP攻击产生反应（图6F），这与浸润肿瘤的内源性肿瘤抗原特异性CD8+T细胞形成鲜明对比（图4E，F）。总体而言，NP/MP抗原处理可导致更高的CD8+T细胞浸润率（图4G）。作者进一步考察了TdLN诱导的ICB能够增强免疫治疗作用（图4H-K），TdLNs的干样细胞和CD8+T细胞进入循环中从而导致TME浸润和抗肿瘤作用，表明TdLNs能够诱导CD8+T细胞产生抗肿瘤免疫效应（图4L，M）。
图6.TdLNs的CD8+T细胞增殖促进肿瘤浸润性T细胞的抗肿瘤功能
总结
不同的抗原转运机制使得LNs内具有抗肿瘤功能不同亚群的T细胞具有抗肿瘤免疫效应，对于具有高免疫检查点表达和高T细胞浸润的患者，ICB疗法最为有效。作者发现，淋巴引流疫苗通过扩展CD8+T细胞库，进一步增强免疫疗法，这些CD8+T细胞能够响应ICB治疗，促进肿瘤抗原特异性CD8+T细胞的增殖，免疫疗法还被发现对于免疫力较高的“热”肿瘤患者更有效。dLN内的T细胞扩增之前，基于MP的疫苗首先在局部组织中募集并激活APC，通过增加功能性效应T细胞向TME中的浸润来使肿瘤变得更热。随着癌症免疫疗法中生物工程学方法的出现以及LNs作为治疗策略的新认识，靶向淋巴的药物输送创新策略成为改善黑素瘤转化治疗的新方法。
文章来源：M.J.O’Melia,etal.QualityofCD8+Tcellimmunityevokedinlymphnodesis