摘要：我们遇到具有独特组织学特征的胰腺肿瘤，与任何已知的胰腺肿瘤或其他部位的肿瘤都不相符。我们的目的是确定它们的临床病理特征及以及它们是否具有特征性的分子改变。对8例确诊病例进行组织学和免疫组织化学研究。同时入选病例还进行了全外显子组测序(WES;n=4)、RNA测序(n=6)、ArcherFusionPlex分析(n=5)、IlluminaMethylationEPIC(k)阵列平台甲基化分析(n=6)和TERT启动子测序(n=5)。6例肿瘤发生在女性。年龄26~75岁，平均43岁。5例发生在胰头/颈部。所有患者均接受手术治疗，无一例接受新辅助/辅助治疗。经过53个月的中位随访(范围：8-94个月)后均无疾病。肿瘤边界清楚，中位大小为1.8cm(1.3~5.8)。镜下，肿瘤无包膜，具有上皮样细胞巢和梭形细胞束交替的特征。部分区域有致密的纤维组织包绕肿瘤细胞呈裂隙状分布。多数上皮样细胞胞浆稀少，胞核圆形，染色质开放。梭形细胞胞核不规则、深染。核分裂罕见。未发现淋巴结转移。所有肿瘤均呈波形蛋白、CD99和细胞角蛋白(片状)阳性，而实性假乳头状肿瘤、神经内分泌、腺泡、肌源性/横纹肌样、血管、黑素细胞或淋巴分化、胃肠道间质瘤的标记及MUC4均为阴性。全外显子组测序显示，在任何已知的癌基因或抑癌基因中，没有反复发生的体细胞突变或扩增/纯合缺失。RNA测序和ArcherFusionPlex检测也没有检到任何可能导致复发的致病基因融合。单样本基因集富集分析显示，这些肿瘤可能表现为间叶转录程序。针对一组不同的间叶性肿瘤，对其甲基化特征进行非监督分析(t-SNE)，显示了一种不同的甲基化模式。在这里我们描述了一种具有独特的形态学/免疫表型和甲基化特征的胰腺肿瘤，同时未发现任何异常的关键的遗传驱动基因，支持这些肿瘤代表了一种新的类型，具有相对缓慢的临床病程。鉴于胰腺间充质转录的特点，我们建议将其命名为“硬化性上皮样间质肿瘤”。
引言
胰腺会发生一系列具有导管、腺泡和神经内分泌分化的上皮性肿瘤，以及未明确细胞谱系的实性假乳头状肿瘤。此外，大多数在其他部位认识充分的间叶性肿瘤也可罕见发生在胰腺内。在过去的几年里，我们遇到了一种具有独特的组织学特征，不符合任何已知类型的上皮性肿瘤特征的胰腺肿瘤。事实上，这种肿瘤也不同于发生于其他部位的上皮性肿瘤和间叶性肿瘤。它们的特点是上皮样细胞和梭形细胞在密集硬化的间质中形成界限清楚的细胞巢，我们将这种组织学类型称之为胰腺“硬化性上皮样间质肿瘤”。
在目前的研究中，我们分析了8例这样的病例，并分析了它们的组织学特征、临床行为和分子基础。在完整评估了在鉴别诊断中可以考虑的一系列明确的上皮和间叶肿瘤后，我们认为，基于它们显著和独特的形态学、免疫组织化学和分子特征，这些病例代表了一个新的实体类型。
材料和方法：
略
结果
临床病理特征 每个病例的临床病理表现包括年龄、性别、肿瘤部位和其他相关特征概括于表1和补充表2。
表1分析病例的临床病理特征
在这8例中，6例发生在女性，2例发生在男性。年龄26~75岁，平均43岁。1例患者在胰腺病变前8年诊断为肾细胞癌。5例病变位于胰头/颈部，1例位于胰体，两例位于尾部。有临床资料的3例中无1例血清肿瘤标志物(CA19.9和CEA)升高。所有患者均接受手术治疗(6例根治切除，2例切除)，无1例接受新辅助或辅助化疗。中位随访53个月(范围：8-94个月)，所有患者均存活，无疾病复发或转移的证据。
肉眼观察，6例肿瘤局限于胰腺。其余两例肿瘤，1例侵犯胰周脂肪组织，另1例侵犯十二指肠。肿瘤大小中位数为1.8cm(1.3~5.8)。肿瘤没有包膜，但边界清楚；切面灰白，质硬(图1A)。
光镜下显示为伴有广泛纤维化的实性肿瘤，周边有淋巴细胞聚集(图1B)。肿瘤细胞的密度不仅在肿瘤之间有差异，而且在每个肿瘤中也有显著差异，形成了富于细胞和稀疏细胞区域的疏密相间形态(图2)。在一些区域，肿瘤细胞形成富于细胞的细胞巢；另一些区域显示致密的透明纤维化，仅有罕见的肿瘤细胞巢。也有一些线状排列的肿瘤细胞围绕在透明变性胶原灶周围浸润(刚果红染色阴性)，呈裂隙样(图3)。未发现真正的上皮结构，如腺体、乳头或假乳头。同样，没有出血、坏死、泡沫状巨噬细胞簇或嗜酸性小球。肿瘤细胞也表现出不同的形态。肿瘤细胞多为上皮样至梭形，胞浆稀少，无糖原或粘蛋白(PAS染色阴性)，胞核圆形至椭圆形，染色质开放，有的核仁明显，无核沟或凹陷。这些细胞与一些形态不规则、细胞核深染的细胞混杂在一起(图3)。偶有核分裂像(范围：0-3/10HPF)。无淋巴血管浸润，但2例有神经周围侵犯。在肿瘤周围，纤维化和肿瘤细胞包绕周围的胰腺实质。在1例中，肿瘤浸润至胰周脂肪组织，在另1例中，肿瘤浸润至十二指肠。6例切除标本均未发现淋巴结转移。
图1.肿瘤边界清楚，呈实性。切面为灰白色，质实或硬化(A)。切片显示上皮样和梭形细胞肿瘤伴广泛纤维化，以及周边致密淋巴细胞聚集(B)。
图2.肿瘤细胞密度在不同肿瘤之间及肿瘤中的不同部位均有明显差异。虽然在某些区域肿瘤细胞形成富于细胞的细胞巢(A)，但其他区域显示致密的透明状纤维化，仅有罕见的肿瘤细胞巢(B)。
图3.肿瘤细胞形态多样。大多数细胞为上皮样，胞浆少，胞核圆形至椭圆形，染色质开放，部分核仁明显(A)。梭形细胞更多表现为不规则、深染的细胞核(B)。
免疫组化上，所有肿瘤均阳性表达vimentin(弥漫)、CD99(弥漫膜)和细胞角蛋白(AE1/3和CK18，均为斑片状；图4)阳性。1例(例3)肿瘤呈斑片状弱表达Syn，所有肿瘤均为CgA阴性。S也在例3中局灶弱阳性，实性假乳头状肿瘤的标记（异常的β-catenin核阳性、孕激素受体、CD10），腺泡细胞标记（胰蛋白酶、糜蛋白酶），肌源性标记（desmin、myogenin)，脉管标记(ERG，CD31，和CD34)，黑色素细胞标记（S，HMB45，Melan-A)，胃肠道间质瘤标记(CD，DOG1)，以及TTF1，HepPar-1，MUC4，BCL2，ALK，STAT6，CD21，CD35和CD45在肿瘤中都是阴性表达（表2）。
图4.所有肿瘤均呈vimentin、CD99和细胞角蛋白(AE1：AE3和CK18，均呈斑片状)阳性，而实性假乳头状肿瘤、腺泡样-肌源性/横纹肌样、血管、黑素细胞、淋巴细胞分化以及MUC4均为阴性。
表2免疫组化分析结果
最后，1例(例1)进行了电镜检查，显示非特异性表现，包括偶见桥粒、核周张力细丝和丰富的粗面内质网。
分子特征
全外显子测序分析显示这些肿瘤为低突变负荷，体细胞突变中位数为15(范围：9-35)，非同义体突变(图5；补充表5)中位数为9.5(范围：8-26)。没有发现反复发生的体细胞突变或反复发生的突变基因(图5A)。仅在1例(例4)中发现1个非同义体细胞突变，影响到一个已知的癌症基因(DDX6)，并且大多数突变(89%)被预测为乘客突变(补充表5)。同样，拷贝数分析没有发现任何重复的扩增或纯合缺失。事实上，肿瘤表现出低水平的遗传不稳定性，很少有基因拷贝数改变(图5B)。根据微卫星不稳定性传感器(图5A)的定义，所有被测试的肿瘤都是微卫星稳定性。最后，TERT启动子区域的Sanger测序没有确定任何已知的TERT基因启动子热点区域(图5A；补充图1)。
图5.胰腺硬化性上皮样间叶性肿瘤的基因组和转录学特征。A.用全外显子测序检测胰腺硬化性上皮样间质肿瘤中的一个非同义体突变。图中显示了每个突变的突变类型(左)和癌细胞比例(右)，并根据图例进行了颜色编码。栏目(顶部)提供了有关TERT启动子热点突变和微卫星不稳定性传感器评分的信息。Indel小的插入和缺失，MSI微卫星不稳定性，SNV单核苷酸变异。B.对4例胰腺硬化性上皮样间叶性肿瘤进行全外显子组测序的染色体图谱。log2-比率根据基因组在x轴上的坐标在y轴上的比率绘制。C.对6例胰腺硬化性上皮样间叶性肿瘤进行RNA测序的基因集富集分析结果。发现富集的路径显示在每个区域的标题中。
RNA测序分析没有发现任何与复发相关或功能性的可能致病融合基因(即框内、具有完整功能结构域和高驱动概率的融合基因；补充表6)。一项定制的ArcherFusionPlex检测证实，涉及62个已知目标基因的基因融合缺失。
为了评估胰腺硬化性上皮样间叶肿瘤的转录程序，我们对转录数据进行了GSEA。这项分析揭示了与细胞外基质相关的通路，局灶性粘连、紧密连接、粘连连接和转化生长因子β信号富集于这些病变中(图5C)。以前的研究报道了这些通路在间叶来源的细胞中的激活/富集。
通过聚类分离和t-SNE分析，甲基化图谱的非监督分析显示出明显的甲基化特征。硬化性上皮样间叶肿瘤与作为参照的其他间叶性肿瘤的最易变的20，个非XYCpG位点相比形成了一个独特的簇(图6)。
图6.对变量最多的20，个CpG位点的非监督分析(t-SNE降维算法)显示，与其他间叶肿瘤相比，这些胰腺肿瘤与鉴别诊断的肿瘤相比具有明显的聚集性。
讨论
本文描述了8例迄今未被报道的胰腺肿瘤，这些肿瘤主要发生在中年女性患者的胰头颈部，如果不是完全良性，也是一个惰性的临床过程。肿瘤表现为实性、边界相对清楚，由上皮样到梭形细胞组成，细胞核中度不典型，偶见核分裂像。胶原化程度不一，包括细胞纤维带以及细胞束之间的绳索状胶原沉积。肿瘤周边有丰富的淋巴细胞聚集。为了研究这些罕见肿瘤的组织发生及临床诊断，我们使用一组针对各种鉴别诊断的肿瘤的抗体对这些病例进行了免疫组织化学研究。结果显示肿瘤仅表达vimentin、CD99和细胞角蛋白，是非特异性表现，不支持与任何已知类型的胰腺原发性上皮性肿瘤的特定关系。此外，为了确定这类肿瘤是否可能由高度重复的体细胞遗传改变所驱动，我们进行了广泛的分子分析，包括全外显子体测序、RNA测序和靶向Sanger测序。这些研究还显示，普通致癌信号通路的改变发生率非常低，因为肿瘤没有表现出任何反复发生的突变、扩增、缺失或可能的致病基因融合。
鉴于缺乏可识别的细胞系，这些肿瘤的鉴别诊断具有挑战性。具有显著硬化和上皮样成分的多种肿瘤，包括罕见发生于胰腺的肿瘤，都被考虑在内(表3)。免疫组织化学和分子分析对于充分探讨鉴别诊断是必不可少的，在这种情况下，免疫组化不支持其他肿瘤诊断可能性，从而支持硬化性上皮样叶性肿瘤是胰腺中的一种新的肿瘤实体型这一观点。
从理论上讲，由于病变边界清楚和硬化，胰腺错构瘤在鉴别诊断中可以考虑。然而，光镜下，胰腺错构瘤显示出一种无序排列的大小不一的囊性导管结构，内衬立方或扁平上皮，周围绕以包埋于炎细胞浸润和少细胞间质中的分化良好的腺泡。我们认为这个病理表现也基本上排除了所有具有明确细胞谱系的胰腺上皮性肿瘤。然而，未定谱系的胰腺肿瘤类型，即实性假乳头状肿瘤理论上需要考虑的。虽然实性假乳头状肿瘤可能硬化，但硬化性上皮样间叶肿瘤中没有典型的假乳头状结构和特征性的核；而且，实性假乳头状肿瘤通常阴性或非常局灶性表达细胞角蛋白，始终表达PR和CD10。此外，实性假乳头状肿瘤有CTNB1活化基因突变，因此显示弥漫性核β-catenin染色[37]；在硬化性上皮样间叶肿瘤中没有发现这些发现。
由于间叶的形态以及波形蛋白和弱的细胞角蛋白表达，鉴别诊断包括肉瘤样癌和表达角蛋白的真性肉瘤，如尤文肉瘤/原始神经外胚层肿瘤，硬化性上皮样纤维肉瘤，软组织或唾液腺的肌上皮肿瘤。事实上，其中1例最初被诊断为“间变性癌”。然而，应该注意的是，大多数胰腺肉瘤样癌被认为是导管腺癌的变异型，是较大的浸润性肿瘤，表现出明显的细胞多形性、坏死和增殖活性，以及较高的突变负荷，KRAS热点突变和TP53、Smad4和CDKN2A突变，这是大多数导管谱系的胰腺癌的典型特征。此外，肉瘤样癌是一种致命性很强的恶性肿瘤。这些特征中没有1个存在于硬化性上皮样间叶肿瘤中。同样，尽管有CD99的表达，但缺乏特征性的EWSR1基因重排不支持尤文肉瘤/原始神经外胚层肿瘤以及硬化性上皮样纤维肉瘤或软组织肌上皮瘤的可能。
值得注意的是，考虑到形态学特征，包括上皮样细胞有透明或嗜酸性的细胞质浸润在致密的硬化性间质中，同时有波形蛋白的表达，硬化性上皮样纤维肉瘤是我们对几个病例的建议诊断，尽管它在内脏器官中非常罕见。然而，与硬化性上皮样纤维肉瘤不同，根据RNA测序和ArcherFusionPlex分析，这几例分析的肿瘤缺乏S和MUC4表达，无EWSR1-CREB3L1或FUS-CREB3L2融合基因，也没有任何其他重复表达的嵌合基因。
CD99广泛而微弱的膜性表达，以及一些组织学特征，引起诊断血管瘤样纤维组织细胞瘤的可能性。然而，缺乏囊性、出血性腔隙、Desmin表达阴性和EWSR1-CREB1、EWSR1-atf1或FUS-atf1融合，结合我们病例中发现的细胞角蛋白标记，对于这种疾病实体少见的。我们还进行了BCL2、CD34、ALK和STAT6免疫组织化学检查，以确定是否存在胰腺内孤立性纤维性肿瘤或炎性肌纤维母细胞瘤的可能性，但这些表达均为阴性。同样，缺乏S标记排除了软组织或唾液腺的肌上皮肿瘤、黑色素细胞瘤的诊断，同时排除了神经鞘瘤。血管周上皮样细胞肿瘤可显示平滑肌(SMA，desmin)和黑色素细胞(HMB-45，Melan-A)标志物以及TSC1/TSC2突变。缺乏CD、Dog1、CD34表达，以及KIT或PDGFRA受体酪氨酸激酶突变不支持胃肠道间质瘤。淋巴造血系统肿瘤，如郎格汉斯细胞组织细胞增生症和滤泡树突状细胞肉瘤，CD1a、CD21或CD35呈阳性。
因此，由于研究没有指出特定的细胞谱系，我们也不能将这类肿瘤与任何其他先前定义的实体肿瘤等同起来。然而，值得注意的是，基于RNA测序的基因集富集分析提供了证据，表明这里分析的肿瘤要么显示为间叶起源，要么表现为向间叶分化。有趣的是，与其他参考的间叶源性肿瘤相比，这些肿瘤显示出明显的甲基化特征，形成了一个独特的簇(图6)。
这项研究有几个局限性。首先，考虑到这种肿瘤罕见，我们的样本量很小。然而，我们和其他人已经证明，对于4个样本，如果病原融合基因或体细胞突变出现在大于70%的病例中，我们就有80%的统计能力来检测该致病原融合基因或体细胞突变。其次，我们只对蛋白质编码基因进行了全外显子组测序分析，从福尔马林固定的石蜡包埋样品中提取的RNA进行了RNA测序分析，可能会导致一种影响非编码元件的致病基因突变的识别。有必要积累更多例数对该实体型肿瘤进行进一步研究。
总之，虽然组织学特征独特，并有较多的特异性诊断考虑，但大量的免疫组化研究未能将这类肿瘤与公认的上皮或间叶性肿瘤相联系，而且迄今为止的分子研究尚未揭示出特定的遗传学变化，除了通过基因集富集分析激活/富集某些通路，包括细胞外基质、紧密连接、粘附连接和转化生长因子β信号转导通路，这些都是间质起源肿瘤的典型途径。甲基化谱也证实为独特的甲基化特征。因此，这个疾病实体似乎是胰腺所独有的，并且以前没有被描述或命名。鉴于无法明确特异性细胞谱系，我们提出描述性术语“硬化性上皮样间叶肿瘤”。这些病例的随访信息未显示出恶性行为；然而，由于我们研究的病例数量很少，随访也有限，现在将其定义为完全良性的生物学行为还为时尚早。认识到胰腺硬化性上皮样间叶肿瘤可能有助于识别更多这样的病例，从而获得更多关于这种罕见肿瘤的临床病理和预后特征的信息。
原文出处：BasturkO,WeigeltB,AdsayV,etal.Sclerosingepithelioidmesenchymalneoplasmofthepancreas-aproposednewentity.ModPathol,ModPathol.Aug5.doi:10./s---5.[Epubaheadofprint]
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