蓝景刚1，胡宏2
(1．英国利兹大学生物化学与分子生物学系分子免疫学研究室IS29JT，UK；2．重庆医科大学医学检验系，重庆)
2粘膜免疫系统
粘膜表面代表宿主与环境之间的界面，是最普遍的抗原进入门户。粘膜表面与环境接触，不断暴露于来自微生物的抗原。肠粘膜暴露于来自食物的抗原，呼吸道粘膜暴露于吸入的抗原。因此，粘膜淋巴组织承担着免疫保护所必需的几种功能。粘膜表面的总面积远大于皮肤，其潮湿、营养丰富的分泌物为众多潜在的病原微生物提供了理想的介质。成人胃肠道总粘膜表面达～m2，是机体与环境接触最大的面积。
粘膜免疫系统在高等哺乳类动物是由粘膜相关淋巴组织、淋巴样的粘膜相关细胞及保护宿主的效应分子组成的整合网络。主要的效应分子包括以分泌型IgA(secretoryIgA，slgA)为主的抗体分子、细胞因子、趋势因子及其受体与天然宿主因子如防御诱导的免疫功能协同。在解剖上粘膜免疫系统分为与外来抗原相遇、选择性摄取、激发免疫应答的部位和更弥散的B和T淋巴细胞聚集、分化的浆细胞、巨噬细胞和其他抗原提呈细胞及嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞分布的效应部位。
2．1粘膜相关淋巴组织(mucosal—associated1ymphatictis—sue，MALT)粘膜表面的一个特点是淋巴样组织有规则地集合称为MALY。它们在粘膜表面不仅具有相似的淋巴样组织部分，而且功能也相似。AMLT的显著特点是局部产生IgA。在一个粘膜表面产生的激活淋巴细胞可再循环，选择性地定位于其他粘膜表面。胃肠相关淋巴组织(gutassociat—edlymphatictissue．GALT)是MAL的一部分。包括淋巴集结(Peyer’spatch，PP)、阑尾、肠系膜淋巴结(mesenteric1ymphoidnode，MIN)和固有层淋巴组织。
GALT产生的IgA和B淋巴细胞在其正常成熟和从GALT小结移行、回到胃肠固有层的过程经过的路线几乎形成一个完全的循环，因此称为IgA细胞环。粘膜B淋巴细胞群有3个特点不同于系统免疫的淋巴细胞：(1)在静息状态下能穿过粘膜淋巴滤泡并可接受透过特定上皮细胞的抗原刺激。(2)能作为浆母细胞移动到固有层。(3)具有转化为产生IgA的倾向。粘膜T淋巴细胞也能穿过牯膜滤泡，并在效应阶段移行到固有层，通过细胞因子的产生，诱导IgA浆细胞和IgA分泌。在诱导和选择性影响下，粘膜T淋巴细胞和B淋巴细胞群倾向于共同表达。增殖和转化为产生IgA通常发生在GALT的淋巴小结构。来自于循环骨髓的B细胞毛细血管后微静脉(highendothelial、enlule．HEV)处随机或有选择性地到达PP，在该处分裂，通过转型T细胞诱导IgA转型分化，从IgM转化为IgAB细胞，离开PP。
由淋巴转运到肠系膜淋巴结，在那里成熟为IgA浆母细胞，它们离开输出淋巴进入胸导管，由此入血循环。淋巴样细胞(幼推细胞、浆细胞)在胃肠各个部位被传递到固有层，在那里成为IgA浆细胞、记忆细胞，通过淋巴小结的HEV再循环。在来自于血循环的激素(雌激素、孕酮和催乳素)影响下，不成熟的粘膜B淋巴母细胞移行到外分泌腺，如乳腺，在那里成熟为浆细胞。在该处也可见到T细胞，并具有与B细胞类似的生活周期，且T辅助细胞亚群占优势，提示在乳腺T细胞也调节B细胞的发育。
IgA诱导部位的刺激可导致远端部位如鼻咽部和生殖道的普遍保护作用。口服免疫的母亲乳汁中的slgA抗体可保护哺乳婴儿的胃肠道和上呼吸道，除胃肠和支气管相关淋巴组织外，在扁桃体和直肠也具有前体细胞池，分别优分布于上呼吸道、大肠、小肠和生殖道。这种共同粘膜免疫系统的存在用于设计新型疫苗，可保护通常不易接触的粘膜腺体表面。动物和人体试验表明，口服免疫刺激GALT可用于诱导几种远离胃肠部位感染微生物的分泌免疫应答。
2.2抗原的识别、摄取在肠道定居着种以上不同的共栖细胞，GALT如何区分病原与正常肠道菌群？
病原微生物的毒力基因使它们能定植、侵袭进而在细胞内生存。一旦上皮被突破，要限制粘膜入侵者则需要快速的宿主应答。这一任务就由天然免疫系统来承担。微生物通过激活一种进化上保守的原始谱型识别系统来启动宿主的保护性应答。对这些病原相关分子谱(pathogen—associatedmolecularpatternPAMP)的一类谱型识别受体是最初从果蝇发现的Toll受体，是抗真菌免疫的关键。
一些哺乳动物也具有相应物质，即Toll样受体(Toll—likereceptor．TLR)。在人类已发现至少10种TLR。TLR参与识别各种微生物产物，但通常是微生物必需结构成分：TLR2识别革兰阳性菌的脂磷壁酸(1ipote—ichoicacid，LTA)、肽聚糖和脂蛋白，TLR3识别病毒双链RNA，TLR4对脂双糖(1ipopo1ysaccharide，LPS)特异，TLR5识别细菌的鞭毛蛋白，TLR9细菌特有的非甲基化CpGDNA，TLR2与TLR1和TLR6协同识别一套独特的配体。TLR通过MyD88，进行白细胞介素(interleukin．IL)一1受体相关激酶(IL一1R—associatedkinase，IRAK)和肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor，TNF)受体相关因子6(TNF—recep—tor—associatedfactor6.TRAF6)信号传导。TLR介导的识别和信号传导在获得性免疫应答的起始和T细胞分化成T辅助(Thelper，TH)1效应细胞的诱导中起关键作用。
尽管肠内抗原大部分被上皮屏障阻隔不能进入宿主组织，但通常抗原有两个途径从肠道进入。其一是一种散在分布上皮单层的特化上皮细胞，其顶端表面缺乏绒毛肠细胞特有的刷状缘糖衣，而代之以抗原易接近的微褶(microfold.M).故称M细胞，它利用跨上皮囊泡运输系统将微生物携带给其覆盖的(AIT呈递抗原细胞(antigenpresentingcelj．APC)。M细胞位于GAIT的诱导部位，即PP。PP是主要见于小肠远端肠的淋巴样滤泡集结。M细胞位于滤泡棚关上皮的圆顶状结构内，早已被认为是粘膜免疫系统的门户。
另一途径上一种职业PAC。即树突状细胞(dendriticcel1.DC)，它可以伸出树突状突起，穿过上皮紧密连接，从肠腔直接摄取抗原。在这一过程中，由肠细胞和DC自身表达的蛋白重新形成紧密连接而保护屏障的完整性。在上皮圆顶下等候的巨噬细胞和DC正好能监视进入PP的微生物。TIR信号然后诱导共刺激分子的上调，这是幼稚T细胞激活所需要的“第二信号”。然而，TLR识别的微生物必需结构成分在共栖菌群和病原体是相同的。为什么肠道菌群不能通过TIR信号不断地激活天然免疫系统而导致不断的炎症呢？部分解释可能是在大多数情况下。共栖菌不能到达PP。它们仍被丝状的刷状缘糖衣提供的物理屏障网络在覆盖上皮的粘液层被封闭不能到达细胞表面。实际上从数量上讲，正常菌群是阻断病原体到达上皮表面的关键，然而答案不能简单地归咎于共栖菌物理排除于上皮本身。在小鼠，诱导对共栖菌群的粘膜IgA应答即不需要T细胞辅助。又不需要有组织的滤泡淋巴样组织。分泌对共栖菌细胞壁抗原特异的lgA浆细胞弥散分布于整个肠道固有层。抗共栖菌IgA应答需要肠道菌群的存在，似代表一种特异性粘膜防御在进化上古老的形式。现已明确这种T细胞非依赖性IgA途径甚至存在于MT小鼠，该小鼠缺乏IgM的跨膜形式。MT小鼠在B细胞发育中停止于前B阶段，而前B细胞的存活、增殖和进一步分化需要跨膜1g重链。Zinkemagel等的研究表明存在另一种B细胞分化途径，该途径以早期表达免疫球蛋白一重链为特征。这些细胞主要分布于GALT。提示转型为IgA(而非其他Ig型)需要一种来自于胃肠道的信号，可能为转化生长因子(transforminggrowthfactor.TGF)一。随后T细胞非依赖性IgA分泌性B细胞可能受到共栖菌抗原持续存在得以维持和驱动。
Rescigno[32]等观察到病原和非病原性细菌均被DC摄取并转入上皮，但在肠绒毛深层见不到携带非侵袭性细菌的DC。这表明病原性细菌可诱导DC成熟和转移，而共栖菌却不能。DC分辨病原和非病原性细菌的能力可能部分与TIR或TIR组的鉴别信号传导有关。已知的TIR细胞因子信号传导能力是不等的。一些TLR联合表现独特的细胞因子程序，提示存在一种根据识别的微生物类型调节诱导的细胞因子机制。在肠粘膜PP固有层的职业APC不是表达TLR的唯一细胞。肠上皮细胞也具有表达TIR和分泌多种细胞因子和趋化因子的能力通过肠细胞上TIR信号传导是否直接导致细胞因子分泌尚不清楚。在一些上皮模型中。细菌LPS可激活核转录历子NF—B。该因子是以炎症应答为特征的细胞因子分泌程序的主要开关，在肠粘膜也是如此，炎症性细胞因子可启动巨噬细胞杀菌活性。诱导反应氧和氮中间产物的产生。随后的获得性免疫应签也与三皮细胞衍化的趋化因子相协调。在小肠内,肠细胞，特别是那些滤泡相关上皮内的肠细胞分泌趋势因子巨噬细胞炎症性蛋白3一(MIP-3；CCL20)。
CCL20特异性地吸引不成熟的CCR6一、CD11b髓样DC到PP上皮下圆顶去摄取微生物抗原。除前炎症作用外，新近的证据表明，肠上皮直接参与调节GALT的抗炎症作用。尽管肠内存在大量细菌，在健康人肠粘膜很少见到中性粒细胞。上皮表面的物理屏障虽能排除大量共栖菌，但仍有一些能通过。在体外模型，非病原性细菌粘附在上皮抑制通过NF—B／IB途径的前炎症细因子转录。细菌的粘附显然阻止抑制性B(IB)降解，避免NF—B的释放及其转运到细胞核内。这些观察表明通过共栖菌的信号传导可保持这一主要开关关闭，直到病原识别将其打开。
2.3特化的免疫球蛋白和T细胞在胃肠道、上呼吸道、唾液腺、鼻、泪腺、中耳、胆囊、乳腺和泌尿道粘膜产生IgA的浆细胞数大大超过其他表型的浆细胞数，可见IgA在这些部位乃至整个身体防御中的重要性。单是成人小肠IgA产生细胞就达5×，若加上其他粘膜部位的IgA浆细胞数目，体内约75％的所有Ig产生细胞产生IgA。人类IgA有两个亚型：IgA1和lgA2，产生这些亚型的细胞分布于不同区域。在脾、外周和肠系膜淋巴结、扁桃体、胃和十二指肠，IgA1多于IgA2。在泪腺和唾液腺，两种亚型细胞数量相当。IgA2产生细胞主要见于大肠。构成PP的淋巴样滤泡集合体是弥散于整个小肠和大肠的最易识别的滤泡。像淋巴结一样，PP具有B细胞滤泡和由主要被T细胞区域包围的生发中心。GALT也含有疏松组织的效应部位，主要位于肠绒毛的固有层内。在固有层内的淋巴细胞大部分为分泌IgA的浆细胞和记忆性T一效应细胞。
抗原通过M细胞或DC越过粘膜上皮，接触APC导致通过HEV进入PP的B和T细胞在整合素如4、7存在下，TGF一在滤泡DC和其他细胞因子如IL一4、IL一5、IL一10的存在下，促进IgM+B细胞向IgA+B细胞在生发中心的转型。通过B细胞上TGF一／TCF一受体Ⅱ的信号传导是向IgA转型的关键。TGF一在GALT大量表达，是GALT两个最独特功能的中心。这两个最独特功能是分泌IgA和产生调节性T细胞。IgA是一种非炎症性Ig，几乎不结合补体。尽管IgA在粘膜表面大量产生，但血循环中的IgA要少得多。而且系统的IgA以单体循环，典型的粘膜IgA以二聚体分泌。IgA通过与肠细胞基底面固有表达的多聚Ig受体(poly—mericimmunoglobulinreceptor.pIgR)转运到顶端表面，在此附着在IgAFc段的pIgR被酶裂解。残留物作为分泌片仍结合在聚体IgA分子上。有助于避免slgA在恶劣的肠道环境中被蛋白酶水解破坏。slgA排除抗原进入上皮的作用早已引人注目，最近发现slgA也起着穿梭服务的作用，利用pIgR从固有层主动地将抗原转运到肠细胞顶端表面。表明slgA担负着双重屏障功能。既守卫着上皮防止微生物进入。又作为固有层的强有力泵将侵入屏障的IgA结合抗原或微生物排回到肠腔。GALT除利用其自身代表性的体液免疫应答外。尚含有不常见的T细胞。
实际上，肠上皮在作为潜在的T细胞群胞腺外成熟的一个重要部位的功能上可能是独特的。最近对小鼠的研究表明，在整个小肠和大肠隐窝和固有层内均发现T细胞前体簇。这些隐窝集结是上皮内淋巴细胞(intraepitheliallymphocyte.IEL)胸腺非依赖性发育所必需的。IEL是在基底膜上位于上皮细胞之间的一种T细胞亚群[33]。肠细胞产生对这些IEL发育重要的IL一7。胸腺外衍化的IEI表达CD同型二聚集体，而非其它部位CD一T细胞表达的CD8异型二聚体。由细菌或病毒感染产生的CD8一记忆性T效应细胞汇集在非淋巴样组织，特别是固有层内等待下一次抗原刺激,类似地，静脉注射可溶性抗原(以细菌IPS为诱导炎症佐剂)也导致CD效应细胞在固有层：集在非淋巴样部位汇集的记忆细胞属于“效应记忆”亚群，区别于在淋巴样器官发现的“中枢记忆”细胞，后者表达趋化因子(C—C基元)受体CCR7。
最近的研究已发现了调节组织特异性移动的趋化因子一受体对，胸腺表达的趋化因子CCL25及其受体CCR9是其中的一对。CCL25选择性表达于人和小鼠胸腺(在此吸引发育中的CCR9胸腺细胞到达胸腺上皮)和小肠(但非大肠)。CCR9实际上见于小肠内所有CD+4和CD+8淋巴细胞。在小鼠，CCL25偏向于绒毛隐窝表达，也提示在IEL胸腺外成熟中的作用。肠归巢受体47和CCR9的双重表达使记忆性T细胞更迅速地应答抗原刺激。记忆性T效应细胞的汇集加强了GALT迅速而有效应答肠道病原反复袭击的能力。
2.4粘膜耐受抗原特异性应答要求APC至少提供两个信号：在I型或Ⅱ型主要组织相容性复合物下呈递的抗原肽和由先天免疫产生的共刺激信号[30]。共刺激家族中研究最透彻的B7—1和B7—2(分别为CD8O和CD86)结合T细胞相应受体CD28或细胞毒性T淋巴细胞抗原4(cytotoxicTlymphocyteantigen4.CTLA一4.CD)。CD80／CD86与CD28或CTLA一4结合导致不同的功能后果：通过CD28信号传导表现为T细胞激活和分化的正信号，而通过CTLA一4的信号传导结果为抑制信号。T细胞配体CTLA一4的高亲和性优先结合表达低水平的CD80／CD86。结果非炎症性可溶性蛋白不启动先天性免疫系统，在低水平共刺激信号下被呈递，诱导无应答。相应，炎症性刺激上调CD80／CD86表达，诱导DC成熟、移动到淋巴结T细胞区，将抗原呈递到CD28+T细胞，启动克隆扩增，诱导获得性免疫应答。
早期研究强调肠细胞在呈递可溶性抗原和诱导口服耐受中的作用。最近证明，在GALT与其他部位一样，DC呈递抗原给输出(肠系膜)淋巴结内的幼稚T细胞，因此负责诱导耐受和免疫。口服可溶性抗原典型地诱导抗原特异性无应答。然而，当这种通常的耐受抗原在粘膜佐剂存在下给予或在一种细菌性菌苗中投入，先天性免疫则被激活，免疫应答则发生。对口服耐受原和免疫原性抗原的早期应答是相同的：短暂的T细胞激活和增殖。在外周暴露于抗原后，与接受和粘膜佐剂一起口吸服抗原的小鼠相比，口服耐受原性抗原的小鼠抗原特异性细胞的增殖能力降低。
在口服耐受的小鼠，抗原特异性克隆随后不能扩增，它们或者变得无应答或者死亡。DC移动典型地与炎症刺激有关，这种炎症刺激诱导它们由不成熟到成熟，优化抗原摄取。成熟DC的主要功能为呈递抗原到输出淋巴结的T细胞。但新的证据表明，在胃肠道，不成熟DC不断拾起凋亡的肠细胞碎片(上皮再生时自绒毛巅脱落)并将它们运输到肠系膜淋巴结T细胞区。DC大致可分为表型和功能不同的两个亚型，髓样(CD11c+CD11b-)DC主要位于PP皮下圆顶内，但也可见于脾边缘区和淋巴结被膜下淋巴窦。淋巴样(CD1lc+CD8+)DC见于淋巴样器官的T细胞区。在小鼠，淋巴样DC与诱导TH1型(炎症性)应答有关，而髓样DC诱导TH2型应答。TH2细胞应答有时等于粘膜耐受。然而，新近研究表明，耐受不单是由TH1偏向于TH2型应答。在PP中DC产生高水平的TH2型细胞因子IL一4和IL—J0，似乎将粘膜免疫应答极化为抗炎症方向。特别地n一10可由位于PP上皮下圆顶内的髓样DC产生。在粘膜表面一个罕见的CDLLbCD8+DC群占大多数可能在该部位起着特殊作用。并且只有PP内DC稳定表达TGF‘mR—NA。另一种口服耐受的机制是由CD8+抑制性T细胞相关的抑制性T细胞，其终点是对随后非胃肠途径进入抗原应答的缺如。TH3细胞可分泌抑制性细胞因子如TGF一是口服抗原诱导的抑制细胞表现为抗原非特异性机制。
因此，口服耐受可遵循两种途径：低剂量抗原导致抗原调节细胞的产生，包括由GALTDC的抗原呈递。这种呈递诱导调节性T细胞(TH3细胞0分泌抑制性细胞因子TGF一和TH2应答(IL一4／IL一10)，通过抑制性效应细胞的产生抑制免疫应答。通过释放抗原非特异性细胞因子(旁立抑制)在靶器官抑制疾病的发生。高剂量抗原通过克隆无能或克隆缺失诱导TH1功能无应答。
2.5胃肠道中细菌一宿主的相互作用尽管哺乳动物胃肠道必须有足够的通透性以利于有效吸收营养，但也必须避免对食物蛋白和共栖菌潜在的损害性免疫应答。先天性防御，如上皮产生的防御素和粘蛋白有助于防止细菌越过粘膜屏障。slgA提供额外的保护。与对病原菌表位的sIgA应答需要抗原特异性T细胞共刺激相反，对共栖菌抗原特异性sIgA在肠粘膜诱导，是Y细胞非依赖性的。非病原性细菌可直接影响肠上皮，限制免疫激活。在培养的人肠道细胞，无毒力的沙门菌株阻止炎症性细胞因子的产生。共栖菌还能帮助强化上皮屏障。多形类杆菌是正常小鼠和人远端肠道微生物群的优势菌，在遗传上为可操纵细菌。多形类杆菌定植于无菌小鼠肠道诱导衰变加速因子、导管素和富含脯氨酸小蛋白一2的表达，衰变加速因子抑制由微生物激活分泌的补体成分引起的细胞毒损害。导管素是一种补体反应蛋白，推断是促进修复损伤上皮的小肠三叶因子受体。富含脯氨酸小蛋白一2参与皮肤屏障功能。
越来越多的证据表明，在出生后早期获得的共栖菌对自身和其他肠道抗原耐受的发育都是需要的，如TH2细胞介导的卵对白蛋白的免疫应答，在无菌小鼠不易诱导口服受，而当给新生小鼠引入一种断奶前菌群的成员，则耐受易感性恢复。西方工业化国家特应性(倾向于过敏)流行的持续增加使人们设想过分卫生的生活方式改变了婴儿期肠道定植的正常菌谱，使对通常无害的食物蛋白和吸入抗原缺乏耐受。内源性胃肠道微生物群与其宿主的关系可由共栖向一定疾病的致病性转变。炎症性结肠疾病(inflam—matoryhoweldiseases，IBD)影响西方社会0.1的人口，包括溃疡性结肠炎(ulcercolitis,UC)和Crohn氏病。IBD的病因与不适当的激活粘膜免疫有关，这种激活与胃肠道对共栖菌的耐受丧失相关。Crohn氏病和UC均对广谱抗生素有一定疗效,但易复发。在人类白细胞抗原B27／2微球蛋白转基因大鼠和缺IL一2或T细胞受体的基因敲除(knock—out，KO)小鼠自发性结肠炎在无菌条件下均不发病。
在普通条件下生长IL一1OKO小鼠发生结节性慢性结肠炎，类似于在人Crohn氏病中所见，而无菌小鼠则不发病。在普通条件下生长IL一1OKO小鼠胃肠组织病理改变前的2周龄时回肠和结肠通透性增加，伴随着一干扰素和TNF一的增加，在无菌小鼠则无此改变。病原性细菌通过与肠上皮相互作用，修饰肠上皮功能以增强其突破屏障并利用宿主粘膜防御功能为其服务，肠炎鼠伤寒沙门菌诱导宿主表皮生长因子的生理性受体酪氮酸磷酸化,启动一种信号传导途径有利于细菌附着在上皮细胞上。致病性大肠埃希菌利用Ⅲ型分泌系统向肠细胞的微绒毛表面分泌一种受体，破坏微绒毛，改变肌动蛋白结构，形成圆顶样固定部位。福氏志贺菌利用M细胞的内吞作用突破上皮屏障。一旦进入细胞，细菌裂解内吞泡，与肌动蛋白和肌球蛋白形成进一步通过基底面侵入上皮的推进尾。益生菌可通过与病原菌况竞争粘附，增强肠细胞之间的紧密连接和加强对病原菌的粘膜免疫来保护肠道。长双歧杆菌SBT分泌的一种细胞外蛋白能抑制产毒素大肠埃希菌对培养的人肠上皮细胞HCT一8的粘附。这种抑制是通过阻止大肠埃希菌与肠细胞上糖脂受体的结合来实现的。产Vero(非洲绿猴肾细胞株)毒素大肠阻菌如大肠埃希菌o：H7是世界范围新出现的食品源性病原菌。Vero毒素与人类出血性肠炎和溶血性尿毒综合征相关，其B亚单位与胃肠上皮糖脂受体结合，A亚单位抑制靶细胞蛋白合成。前炎症细胞因子，如TNF一、IL一1上调糖脂受体的表达，提高Vero毒素的敏感性，增强Vero毒素在发病中的作用。长双歧埃希菌的培养上清鼻饲小鼠，可抑制大肠埃希菌O：H7的Vero毒素活性，干扰Vero毒素B亚单位与糖脂受体相互作用，血清TNF一、IL一1mRNA表达降低，肾小管上皮细胞糖脂受体表达减少。
3双歧杆菌的免疫调节作用
西方发达国家面临着持续增加的免疫介导、胃肠相关的健康问题，如过敏、自身免疫和炎症性疾病。遗传因素不能解释这类疾病的迅速增加。卫生与营养两个环境因素倒是与西方现代生活密切相关。卫生条件的改善，疫苗和抗生素的应用，使通过感染疾病的微生物刺激大大减少。发展含有双歧杆菌、乳杆菌的益生菌的功能性食品旨在“一箭双雕”。双歧杆菌是人胃肠道正常菌群中占优势的有益于健康的细菌，作为益生菌摄入后可以刺激宿主免疫系统。双歧杆菌能够通过免疫排斥、免疫清除和免疫调节加强胃肠防御的各个防线，发挥抗感染、抗炎症和抗肿瘤的作用。
3.1双歧杆菌对天然免疫的调节作用Madsen等将冻干的长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和短双歧杆菌各9×菌落形成单位(colonyformingunit，cfu)，嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种和植物乳杆菌各8×CFU，唾液链球菌嗜热亚种20×CFU，制成益生菌复合物VSL#3。每天用VSL#3以2.8×CFU，管饲IL一10K和对照小鼠4周，发现VSL#3能使IL一10KO小鼠的大肠生理功能和肠上皮紧密连接的完整性趋于正常，粘膜分泌TNF和干扰素减少，组织学病变改善。体外试验发现自VSL#3提取的一种蛋白性可溶性因子能提高T84培养单层上皮细胞屏障的完整性和抵抗沙门菌的能力。许多老年人因淋巴样细胞活性降低而易发感染和非感染性疾病。Gi11等[51]给27位老年志愿者服用乳酸双歧杆菌HN和鼠李糖乳杆菌HN，到3周取血分离外周血单个核细胞，发现服用双歧杆菌和乳杆菌者血中CD56淋巴细胞的比例升高，外周血单个核细胞体外抗K细胞的杀瘤活性增强。随后的试验证明Ls，除自然杀伤细胞(naturalkillercell，NK)数量和活性升高外CD4一和CD25细胞比例和活性也升高，而D8’、CD19和H1A—DR细胞比例保持不变。这些指标在试验前免疫力低下的70岁以上老人增加更明显。Arunachalam等做的类似试验发现乳酸双歧杆菌HN能提高老年人血中干扰素和中性粒细胞的杀菌活性。Park等用巨噬细胞株RAW.7分别与自人分离的和商用双歧杆菌共培养，结果测试的双歧杆菌菌株均能刺激巨噬细胞产生H2O2、NO、II一6和TNF一，效应随菌株而异。Tejada—Simon等发现加热灭活的双歧杆菌或其细胞壁细胞质也能刺激巨噬细胞产生H2O2、NO、IL一6和TNF一，尤以刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生II一6最明显，对脾和PP细胞则无刺激作用。Ha等用逆转录PCR测定双歧杆菌对小鼠脾、肠系膜淋巴结和PP细胞分泌细胞因子的影响，结果持续服用含双歧杆菌酸奶的小鼠干扰素、TNF一、IL一2、IL一4和IL一6mRNA水平降低，在脾脏TNF一降低尤其突出。Teiada—Simon等用乳酸菌1×10。活菌管饲小鼠8小时后，分离腹腔细胞、PP细胞和脾细胞，在有或无丝裂原存在下培养2或5天后，测IL一6、IL一12、一干扰素、TNF一和NO的产生。嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌能提高腹腔细胞IL一6、IL一12的表达，而路特乳杆菌和双歧杆菌却降低腹腔细胞II一6、一干扰素和NO的产生。所有测试的菌株对PP细胞和脾细胞的细胞因子和No均无影响。
3.2双歧杆菌对获得性免疫的调节作用给哺乳期小鼠服用双歧杆菌12天后，小鼠粪便和乳汁中总IgA和抗乳球蛋白IgA明显高于对照。这有助于保护幼鼠和母鼠对食物抗原的暴露。由普通酸奶加上嗜酸乳杆菌、双歧双歧杆菌和婴儿双歧杆菌给小鼠服用3周，其间用霍乱毒素口服免疫2次，小鼠粪便和血中抗霍乱毒素IgA显著高于服普通酸奶小鼠[59]。说明添加嗜酸乳杆菌和双歧杆菌能增强小鼠对霍乱毒素免疫原的粘膜和系统IgA应答。普通酸奶加上嗜酸乳杆菌、双歧双歧杆菌和婴儿双歧杆菌给小鼠服用2周后取脾和PP淋巴细胞，用流式细胞仪分析发现，脾和PP的CD8(细胞毒性T细胞)、CD(B细胞)、IgA+或IgM+均未受摄入乳酸菌的影响，但脾CD4(辅助性T细胞)百分率增加。以青春双歧杆菌和多形类杆菌分别单联定植于无菌大鼠后，青春双歧杆菌单联悉生鼠不能诱导系统IgG和IgA应答，而两种菌单联悉生鼠均能诱导粘膜免疫应答，粪便仅sIgA增加。将这两种细菌同时双联定植于无菌大鼠，则悉生鼠对多形类杆菌的特异性免疫应答显著低于多形类杆菌单联悉生鼠。如将青春双歧杆菌先定植，则对随后定植的多形类杆菌的特异性免疫应答抑制作用更加明显。
Duchmann等发现双歧杆菌、类杆菌和肠杆菌科细菌均能特异性地刺激来自IBD和正常人外周血和肠活检标本中CD4TCR+T细胞增殖，而双歧杆菌与类杆菌、肠杆菌科细菌之间T细胞克隆具有交叉反应性。Gill等[63]将鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌和乳酸双歧杆菌给小鼠口服后，脾细胞对ConA和LPS的增殖反应增强，血清中对口服和系统免疫抗原的抗体应答增强。但脾细胞IL一4或血中CD4、CD8和CD4DFH+细胞百分率未受影响。双歧埃希菌和大肠杆菌在悉生小鼠肠道均能达到很高的数量，但它们调节IgA抗轮状病毒应答的方式完全不同。双歧杆菌的存在对抗轮状病毒IgA应答具有很强的佐剂效应，而大肠埃希菌表现明显的抑制效应。在口服耐受过程中，双歧杆菌可促进TH2介导免疫应答的抑制作用。给无特定病原(specificpathogenfree．SPF)小鼠、双歧杆菌悉生小鼠和无菌小鼠口服耐受原剂量的卵白蛋白，SPF小鼠、双歧杆菌悉生小鼠卵白蛋白特异性IgE和IgG1抗体水平及IL一4合成显著低于无菌鼠。但双歧杆菌表现的作用仅见于新生期定植的小鼠，在更大龄鼠定植则无效。在成年定植细菌的悉生小鼠表现长期耐受，与普通小鼠的耐受具有可比性。相反，定植双歧杆菌和不产肠毒素艰难梭菌的小鼠表现的耐受作用类似于无菌鼠。LPS可能参与革兰阴性菌对耐受的维持。Yasui等发现口服短双歧杆菌可激活小鼠体液免疫系统，提高抗轮状病毒IgA或抗流感病毒IgG产生，能分别保护小鼠抵抗轮状病毒或流感病毒的感染。乳酸双歧杆菌能增强小鼠对鼠伤寒沙门菌、大肠埃希菌O：H7感染的抵抗力，特异性IgA抗体升高，减少断奶小猪轮状病毒和大肠埃希菌相关性腹泻的发生。两歧双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌与富含烷基甘油的鲨鱼肝油一起服用能显著提高小鼠的体液免疫应答。这些乳酸菌与烷基甘油的免疫调节有协同性。
3.3双歧杆菌与肠道炎症和其他症性疾病早产儿由于肠道屏障功能发育不完善，免疫抑制和肠通透性增加使细菌易位，容易发生坏死性肠炎。Butel和Caplan利用悉生生物技术分别建立了新生鹌鹑和大鼠的坏死性肠炎模型，发现产气荚膜梭菌、酸梭菌和副腐生梭菌在坏死性肠炎中的重要作用。婴儿一长双歧杆菌能保护悉生鹌鹑和大鼠抵抗梭菌诱导的类似于人坏死。性肠炎的肠坏死IBD是肠道免疫性疾病，对正常肠道菌群不适当的T细胞反应性可能是重要的病因。Crohn氏病患者粪便中双歧杆菌的检出率降低。在HLA—B27／2微球蛋白转基因大鼠，结肠炎症状自第8周开始出现，而在6周时，肠道定植的类杆菌、双歧杆菌、乳杆菌都已到达高浓度，但以类杆菌最高，而优杆菌和梭菌却检测不到。前炎症细胞因子IL一1、IL一8和TNF一及TH1细胞因子IL一2、IL一12和IFN在8周开始出现，直到17周仍能测到。而TH2细胞因子IL一4、IL一10和TGF一很少检测到。Matsumoto等发现衰老加速小鼠P1／yit株在SPF条件下回肠和盲肠发生IBD。用短两歧杆菌双歧双歧杆菌和嗜酸乳杆菌发酵乳给该鼠服用20周后，组织损伤评分降低，回肠重量和髓过氧化酶活性降低，组织内IgG1和IgG2a减少，肠系膜淋巴细胞培养上清TH1细胞因子IFN一和TNF一降低，相反IL一10的产生增加。将正常小鼠脾或淋巴结衍化的表达高水平CD45RBCD4T淋巴细胞过继给SClD(重症联合免疫缺陷)小鼠，该鼠则发生慢性肠炎萎缩病，在结肠最严重。这是IBD动物模型之一，给这种小鼠口服长婴儿双歧杆菌和唾液乳杆菌能明显降低疾病的严重性。
给UC病人服用以双歧杆菌和嗜酸乳杆菌制成的益生菌制剂一年后，UC复发的危险性大大降低。Gionchetti等用含有3株双歧杆菌的VSL#3益生菌制剂对UC病人慢性肠炎并发症的控制进行了一次双盲、安慰剂对照的临床试验，40个病人随机分为两组，试验组每人每天服用6克VSL#3，持续9个月。结果服用VSL#3的试验组20人仅3例有并发症复发，而服用安慰剂的对照组复发率为％。在一项随机化安慰剂对照的临床试验中。乳酸双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌GG能预防高危儿童特应性湿疹的发生。
3.4双歧杆菌的抗癌和抗肿瘤作用黄曲霉毒素是经常污染食品的真菌毒素，可诱发肝癌。一种减少黄曲霉毒素摄入引起健康问题的潜在方法是通过细菌结合黄曲霉毒素B1。Peltone等测定20株乳酸菌和双歧杆菌体外结合黄曲霉毒素B1的能力，将细菌和黄曲霉毒素B1溶液37C孵育中24小时后用HPIC测定未结合的黄曲霉毒素B1，结果59.7％黄曲霉毒素B1被这些细菌结合。长双歧杆菌结合的嗜酸乳杆菌的完整细胞和细胞内提取物均能够抑制亚油酸过氧化作用28～48，可清除21～52一二苯基一三硝基苯肼自由基21～52。这两种细菌的完整菌体能抑制4一硝基喹啉的细胞毒作用，其中长双歧杆菌抑制细胞毒活性达90％。口服两歧双歧杆菌还能在小鼠肠粘膜抑制铁离子诱导的脂质过氧化。Matsumoto等给老年人服用加乳酸双歧杆菌的酸奶2周，测定粪便中多铵、结合珠蛋白和变异原性，结果精胺、腐胺、亚精胺和尸胺浓度升高，结合珠蛋白减少，说明急性肠炎受到抑制。粪便提取物和沉淀的变异原性降低。短双歧杆菌和婴儿双歧杆菌菌体和细胞菌壁均能提腹腔注射肉瘤S一18O小鼠的存活率，也能抑制腹股沟移植S一细胞的实体瘤生长。但双歧杆菌菌体在体外对肿瘤细胞株病没有细胞毒作用。细胞动力学实验表明，双歧杆菌细胞壁在腹腔注射部位首先诱导中性粒细胞，随后是巨噬细胞。双歧杆菌细胞壁在体外直接激活的这些细胞抑制瘤细胞的生长。
近年以双歧杆菌为肿瘤基因治疗载体的研究引人注目。以双歧杆菌作为遗传工具需要两个基本条件：双歧杆菌复制性载体和有效的转化系统。有3类载体可以在双歧杆菌内复制：(1)以双歧杆菌复制子为基础的载体；(2)与双歧杆菌密切相关的细菌质粒；(3)在各种革兰阳性和阴性细菌内复制的广宿主范围质粒。目前只有从人肠道分离的长双歧杆菌和大肠埃希菌复制。来自于棒状杆菌的两种质粒能在双歧杆菌内复制。双歧杆菌厚而复杂的细胞壁是摄取外源性DNA的障碍。荷兰的TNO研究出有效、可重复的基于电穿孔技术的转化方法：将双歧杆菌与电穿孔缓冲液预先在4C孵育4小时，在生长培养基和电穿孔缓冲液加高浓度庶糖。Yazwa等构建的肿瘤特异性基因工程长双歧杆菌能选择定植于在小鼠建立的实体瘤组织和用7.12一二甲苯蒽诱导的大鼠乳腺癌，特异性地抑制肿瘤生长。
4展望
遗传工程和悉生生物技术是21世纪生命科学的两支劲旅。人类基因组计划和正在不断增加的细菌基因组计划的完成，为双歧埃希菌免疫调节作用的研究带来了新的机遇。时间分辨PCR可以定量分析复杂环境中特定细菌的数量。DNA微阵(microarray)或基因芯片(genechip)技术将成千上万的基因固定在尼龙膜或玻璃片上作为探针，为探索悉生生物系统对正常菌群的转录应答提供了强有力的工具。DNA微阵技术分析表明，多形类杆菌定植于无菌小鼠除加强屏障功能外，还影响调节宿主出生后成熟、营养摄取与代谢、生物异源性物质处理和血管发生基因的表达。在无菌小鼠，参与碳水化合物吸收、复合脂类裂解与吸收的基因表达增加，为无菌小鼠维护体重要比普通小鼠多消耗达30的热量提供了一个潜的在分子解释。用时间分辨定量逆转录PCR分别测定多形类杆菌、婴儿双歧杆菌、大肠杆菌K12和普通小鼠回肠／空肠全菌群定植的悉生小鼠基因表达发现，3种细菌和全菌定植均能诱导小鼠回肠脂酶和血管紧张素一3基因表达，而双歧杆菌和大肠埃希菌只少量增加富含脯氨酸小蛋白2a基因表达。多形类杆菌抑制多种药物抗性蛋白1a和谷胱甘肽S一转移酶基因表达，而双歧杆菌和大肠杆菌则刺激这两种基因的表达，全菌定植对两种基因表达没有影响。悉生生物技术与功能基因组和蛋白质组的研究成果相结合，检测悉生生物模型中宿主和细菌生物化学和生理学方法的发展，将为阐明细菌对宿主生理与出生后发育的影响开辟广阔的前景。
本文转载于中国微生态学杂志2年6月第14卷第3期ChineseJournalofMicroecology．June．2．Vol14No3