夏宏光（来源：受访者）他们发现，ARIH1（AriadneRBRE3UbiquitinProteinLigase1），是负责靶降解PD-L1的E3泛素连接酶。他们还发现肿瘤细胞会通过EGFR-GSK3α-ARIH1信号传导来逃避免疫系统攻击的机制，并提示ARIH1是肿瘤免疫治疗新的潜在药物靶点。4月20日，相关论文以标题ARIH1signalingpromotesanti-tumorimmunitybytargetingPD-L1forproteasomaldegradation发表于NatureCommunications。图
相关论文（来源：受访者）高通量筛选确定促进PD-L1降解的先导化合物该团队对种FDA批准的药物及候选药物进行高通量筛选之后，鉴定了一系列促进PD-L1降解的先导化合物。为了建立一个基于荧光的测定内源性PD-L1膜蛋白水平的高通量筛选模型，夏宏光使用了与藻红蛋白（P-phycoerythrin,PE）结合的PD-L1抗体和干扰素-γ（IFNγ）处理的U细胞（组织细胞性淋巴肉瘤细胞系）。其中，干扰素-γ增强了PD-L1的基础表达水平，使得后者的动态范围更广，因而其结果也更具精确性与说服力。该团队还发现，在这些FDA批准的药物及候选药物中，共有种药物可以降低PD-L1膜蛋白水平。随后，夏宏光根据这些先导化合物参与的信号通路，对阳性药物进行分类，其中包括JAK/STAT通路（TheJanuskinase/signaltransducerandactivatoroftran-ions）抑制剂、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B/mTOR通路抑制剂、细胞周期调节激酶抑制剂等，这些都是已知的能对PD-L1膜蛋白水平发挥调控功能的通路抑制剂。图
筛选可有效降低PD-L1膜蛋白水平的先导化合物（来源：受访者）锁定研究对象——靶向药物ES-已有大量研究表明，表皮生长因子受体信号通路可激发PD-L1表达，并引起肿瘤细胞的免疫逃逸。筛选获得的靶向药物ES-也是表皮生长因子受体抑制剂，是夏宏光参与开发的靶向新药，夏宏光将它定为研究对象。为探索靶向药物ES-诱导PD-L1降解的背后机制，该团队测试了ES-处理后PD-L1是否会发生磷酸化变化，并通过生物质谱等实验证实了PD-L1的降解取决于其胞内段Ser和Ser这两个位点的磷酸化。由于表皮生长因子受体活性丧失会导致蛋白激酶B活性下降，而蛋白激酶B可同时调控糖原合成激酶-GSK3α与GSK3β。为搞清楚到底谁起了主要作用，他们进行了大量实验，并利用生物质谱等技术发现了一系列与PD-L1相互作用的激酶蛋白。其中，ES-处理后，GSK3α与PD-L1膜蛋白的相互作用，显著增强（见下图）。图
PD-L1免疫沉淀后的质谱分析结果（来源：受访者）体外磷酸化等并行实验也证明，表皮生长因子受体抑制剂诱导的PD-L1Ser/位点磷酸化是由GSK3α介导的。E3泛素连接酶登上舞台在理清楚这条通路后，夏宏光又提出了新问题——在使用靶向药物ES-治疗后，究竟是哪个E3泛素连接酶促进了PD-L1的泛素化和降解呢？在分析质谱数据后，他发现除了已知的介导PD-L1降解的Cullin连接酶外，靶向药物ES-还促进了PD-L1与名为ARIH1的E3泛素链接酶的相互作用。同时他还发现，ARIH1的瞬时过表达，可促进PD-L1的K48相关泛素化增强。此外，ARIH1在人肺腺癌细胞H和人胚胎肾细胞中高表达，可“剂量依赖”地促进内源性PD-L1降解，而ARIH1敲除则导致内源性PD-L1水平增加。一系列实验结果表明，ARIH1能直接泛素化PD-L1，并介导其通过蛋白酶体降解。接下来，夏宏光测试了GSK3α介导的PD-L1在Ser/位点的磷酸化是否促进了PD-L1招募ARIH1。他和团队将稳定表达ARIH1的人胚胎肾细胞，转染上野生型PD-L1或耐磷酸化的SA、SA、2SA（SA和SA两个位点的合称）突变体。结果显示，在SA和SA突变的细胞中，ARIH1高表达诱导的PD-L1泛素化大量减少，与此一致的是，ARIH1与PD-L1的相互作用也因2SA突变而显著降低。靶向药物ES-的处理，增强了ARIH1和野生型PD-L1之间的相互作用，但没有增强其和PD-L12SA突变体的相互作用，而GSK3α高表达诱导的PD-L1泛素化，则被ARIH1的敲除所阻断。因此，该团队得出结论，GSK3α驱动PD-L1的Ser/磷酸化，PD-L1随后招募ARIH1并通过K48相关泛素链将自身泛素化，并靶向蛋白酶体降解。图
GSK3α介导的PD-L1的磷酸化促进PD-L1/ARIH1相互作用和ARIH1诱导的降解活体实验效果喜人在活体实验方面，该团队分别使用4T1小鼠乳腺癌细胞、免疫缺陷裸鼠、和野生型正常小鼠，来评估ARIH1在调控PD-L1降解和肿瘤发生中的作用。据悉，当4T1细胞注射到BALB/c小鼠（白变种实验室老鼠，即俗称的“小白鼠“）中时，小白鼠体内可自发产生高转移性肿瘤，并在注射部位形成原发灶。实验表明，4T1细胞在小白鼠中的生长转移特性与人体中的三阴性乳腺癌非常相似。在4T1细胞中高表达ARIH1，对4T1细胞的体外增殖、以及在免疫缺陷裸鼠的生长并没有影响。但是，在免疫功能正常的小白鼠中，ARIH1高表达肿瘤生长受到了极大的抑制，其中大部分小白鼠的肿瘤完全消退。（来源：受访者）同时，在ARIH1高表达肿瘤微环境中，浸润肿瘤的免疫细胞、活化CD8+细胞、毒性T细胞的水平明显增加。并且，ARIH1高表达还导致炎症细胞因子的表达增加，包括干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α、炎性趋化因子CCL-5、以及T淋巴细胞趋化因子CXCL-10等。（来源：受访者）4T1系小鼠乳腺癌细胞，是逃离免疫系统攻击的癌细胞中的佼佼者，ARIH1能使免疫系统发生活跃的炎性反应，这说明ARIH1在促进肿瘤免疫方面发挥了明显作用，诱导ARIH1高表达的药物在肿瘤免疫疗中的应用前景，非常值得期待。那么在人体中，肿瘤细胞也是通过该机制来逃避免疫系统攻击的吗？对肿瘤和其远端组织样本的免疫组化分析显示，ARIH1蛋白水平在远端组织中的水平远高于肿瘤组织。这一发现与细胞与小鼠实验中ARIH1促进PD-L1降解的现象是一致的，这说明人体肿瘤细胞中ARIH1表达的缺失，是导致肿瘤细胞PD-L1蛋白累积的机制之一。但导致肿瘤中ARIH1表达水平下降的机制还有待阐明。图
经EGFR-GSK3α-ARIH1调控的PD-L1膜蛋白降解示意图治愈疑难肿瘤未来可期，“冷肿瘤”变“热肿瘤”考虑到4T1细胞是一种著名的冷肿瘤，PD-1/PD-L1抗体单独使用几乎对4T1肿瘤没有抑制作用，本研究结果还提示，ARIH1不仅可以调控PD-L1降解，而且可以重塑肿瘤微环境，可能是将“冷肿瘤”变成“热肿瘤”的关键分子。夏宏光课题组通过后续的研究已经初步探明ARIH1调控肿瘤“冷”、“热”切换的机制，并开始筛选诱导ARIH1高表达的先导化合物。临床上三阴性乳腺癌也是著名的“冷肿瘤”，PD-1抗体在该适应症上的临床实验已经失败；本研究成果提示，诱导ARIH1表达的药物小分子有望成为治疗包括三阴性乳腺癌在内的一系列“冷肿瘤”的靶向新药。也就是说，在未来的某一天，治愈三阴性乳腺癌、难治性黑色素瘤、非小细胞肺癌等“冷肿瘤”将不再是幻想！年初，夏宏光已成立公司，他表示本次成果也将在该公司进行转化。夏宏光博士也是良渚实验室研究员，负责“分子筛选与合成平台”与个性化药物筛选。良渚实验室是浙江省实验室之一，成立于年7月，定位是“浙江省医学科技策源地，生命健康产业主引擎”。良渚是杭州的一处地名，也是“中华文明的曙光——良渚文化的发祥地”，以“良渚”命名该实验室，足见用意之深远。图
良渚实验室（来源：