天大医工院郑斌和明东仙台病毒免疫佐剂刺激 [复制链接]

近期，天津大医院的郑斌副教授和明东教授在科爱出版创办的期刊BioactiveMaterials上发表研究性文章：常规免疫佐剂的免疫激活能力较弱，无法高效激发免疫系统的抗原呈递功能。

本文独辟蹊径以非致病性的仙台病*（Sendaivirus,SeV）作为活的纳米免疫佐剂，设计了一种可注射式的水凝胶疫苗（SeV-basedhydrogelvaccine,SHV），SeV可通过多种Toll样受体信号通路高效活化并募集树突状细胞（DC），以提高对肿瘤抗原的递呈作用，从而诱导高效的全身性抗肿瘤获得性免疫应答。这种基于SeV病*颗粒的活性佐剂水凝胶疫苗可作为新一代个性化的肿瘤疫苗，为抑制肿瘤的发生提供了一种新思路和新方案。

01

研究内容简介

世界上报道了多例癌症患者因为感染了新冠病*，反而使肿瘤消失的案例。在我们之前的研究中也发现，流感病*、仙台病*等低致病或非致病性的呼吸道RNA病*可以激活多种细胞的Toll样受体信号通路，继而诱导机体的固有免疫应答（ACSAppliedMaterialsInterfaces,,12:；MaterialsChemistryFrontiers,,5,-，封面，年度HOTArticle）。因此，我们独辟蹊径，将非致病性的仙台病*作为一种天然免疫系统的活体激动剂来提高抗原递呈细胞（APCs）对肿瘤抗原的递呈，以期增强肿瘤疫苗的适应性免疫应答效果。

基于以上考虑，我们设计了一种基于SeV的水凝胶疫苗（SHV）。这种新型的抗肿瘤疫苗利用活病*作为佐剂来募集和激活大量DCs，从而有效地激发机体的抗原递呈功能。疫苗中的肿瘤细胞充当“抗原库”，并在近红外（NIR）的触发下释放所有抗原。这些抗原可被疫苗周围的因病*募集并活化的DCs有效转移至淋巴结并递呈给T淋巴细胞，从而诱导全身性抗肿瘤的获得性免疫应答。同时，在近红外辐射下释放的肿瘤细胞DNA片段也可以促进巨噬细胞中STING途径的活化，从而分泌大量的抗肿瘤细胞因子和免疫刺激因子。为了固定肿瘤细胞并防止其在NIR光热杀死之前发生随机迁移，具有温敏特性的生物相容性水凝胶被用作疫苗基质。此外，水凝胶还可以防止SeV引起的红细胞凝结，以确保疫苗的安全性。值得注意的是，SHV和免疫检查点靶标抗OX40抗体（aOX40）的联合使用可以大大提高T细胞的活化率并增强黑素瘤和乳腺癌模型中的免疫应答效果。从理论上讲，SHV可以将任何肿瘤细胞作为“抗原库”，因此具有较大的普适性，可极大扩展其应用范围（图1）。

图1.基于SeV的水凝胶疫苗（SHV）预防肿瘤发生的示意图。我们使用高度生物相容的水凝胶作为疫苗的基质材料，利用其温敏相变的特性固定肿瘤细胞，保证了疫苗的安全性。光敏剂（ICG）用于在近红外触发下破坏肿瘤细胞并精确释放全部肿瘤抗原。同时，光热破坏导致肿瘤细胞的DNA片段化以激活STING途径并分泌I型干扰素。仙台病*（SeV）作为免疫佐剂能够有效地募集并激活树突状细胞（DC），从而进一步激活全身免疫系统。随后，树突状细胞将肿瘤抗原呈递给淋巴结，促使T细胞成熟并诱导记忆T细胞的形成。当相同的抗原再次入侵时，SHV免疫后的小鼠的记忆T细胞将被快速活化并杀死这些入侵的肿瘤细胞。

图2.仙台病*（SeV）通过TLR7/8和TLR3信号通路激活树突状细胞。（a）SeV激活的免疫信号通路的示意图。（b）通过蛋白质印迹分析的BMDC中磷酸化的IRF3和IRF7蛋白表达水平。（c）SeV处理后IFN-β的表达。（d，e）SeV处理24小时后，BMDC中TNF-α（d）和IL-6（e）的分泌水平。（f）经SeV处理后的BMDC成熟比例。（g）用不同的物质孵育小鼠新鲜血液10分钟，以观察红细胞的凝结。比例尺，40μm。

我们在研究中发现仙台病*（SeV）可以通过TLR7/8和TLR3信号通路高效激活树突状细胞，显示了其作为免疫佐剂的高效激活潜力。但天然SeV会引起凝血反应，这影响了其体内应用（图2）。

图3.SHV疫苗的表征。（a）PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物在CDCl3中的1HNMR光谱。（b）在所示温度下20wt％共聚物体系的代表性照片。（c）在25oC下水凝胶的纳米胶束的透射电子显微镜（TEM）图像。比例尺，nm。（d）在37oC下水凝胶的代表性低温扫描电子显微镜（SEM）图像。比例尺，50μm。

（e）在不同温度下PLGA-PEG-PLGA的胶束粒度曲线。（f）共聚物水溶液的溶胶-凝胶转变。（g）ICG溶液的荧光吸收曲线。（h）ICG溶液的荧光发射曲线。（i，j）在近红外（nm，mW/cm2）照射下ICG溶液（80μg/ml）的光热曲线（i）和红外热成像（j）。

我们选用具有生物相容性良好的温敏水凝胶PLGA-PEG-PLGA作为疫苗基质，可用于固定体内SeV和肿瘤抗原，以确保SHV的安全性。同时，我们也验证了光敏剂吲哚菁绿（ICG）能够在NIR触发下释放肿瘤抗原（图3）。

图4.体外SHV的免疫激发性能验证。（a）用ICG/Gel（1μMICG）处理的B16细胞，在NIR照射（nm，mW/cm2，10min）后的活/死细胞染色结果。将活细胞（绿色）和死细胞（红色）分别用钙*绿素AM和碘化丙啶PI染色。比例尺，60μm。（b）通过冻融，超声和光热解获得抗原蛋白的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色。（c）不同处理后IFN-β的表达。（d）通过蛋白质印迹分析的RAW.7细胞中磷酸化的STING蛋白表达水平。（e）不同处理后的BMDC的活化DC比。（f，g）BMDC中TNF-α（f）和IL-6（g）的分泌水平。（h）用含有不同癌细胞作为抗原的疫苗处理的BMDC的成熟DC。（i）图（h）中成熟DC比例。（j，k）用含有不同癌细胞作为抗原的疫苗处理的BMDC中TNF-α（j）和IL-6（k）的分泌水平。

在体外，与对照组相比，SHV会导致免疫相关细胞因子的释放和功能性DCs细胞分化的增加，表明SHV能够高效地激活树突状细胞，提高其抗原递呈的效率（图4）。

图5.SHV的体内免疫激活作用。（a）用于评估C57BL/6小鼠中的免疫激活效率的实验示意图。（b）疫苗注射前后小鼠的代表性照片。（c）体内肿瘤组织，正常皮下组织和皮下疫苗组织中所含的蛋白质的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色。（d）在NIR照射（nm，mW/cm2）下对不同组进行体内红外热成像。（e，f）来自免疫小鼠的血液中IFN-γ（e）和TNF-α（f）的分泌水平。（g）接受不同治疗的小鼠腹股沟淋巴结中激活的DC比例。（h）治疗后组织液中的辅助性T细胞比例。（i）治疗后间质液中的细胞*性T淋巴细胞比例。（j）免疫小鼠脾细胞的体外增殖实验。（k）在体外不同刺激后免疫小鼠脾细胞中的辅助性T细胞的活化比例。（1，m）不同体外刺激后，免疫小鼠脾细胞中IFN-γ（1）和TNF-α（m）的分泌水平。

图6.SHV的免疫记忆效应抑制了肿瘤的生长。（a-d）腹膜液（a），脾脏（b），血液（c）和组织液（d）中的抗B16的抗体滴度。（e）接受不同治疗的小鼠的骨髓中活化的B细胞比率。（f）接受不同治疗的小鼠腹股沟淋巴结中激活的中央记忆T细胞比率。（g）在预免疫的C57BL/6小鼠中注射B16细胞两周后肿瘤的代表性照片。（h）C57BL/6小鼠中肿瘤的生长曲线。（i）在三周评估期内B16荷瘤小鼠的体重变化曲线。（j-1）与注射游离SeV的小鼠相比，小鼠血液中ALT（j），AST（k）和Cr（l）的值。

图7.SHV可以抑制BLAB/c小鼠的乳腺肿瘤。（a）在近红外照射（nm，mW/cm2，10min）后，通过流式细胞术分析小鼠注射部位的细胞凋亡。（b，c）来自免疫小鼠的血液和间质液中TNF-α（b）和IFN-γ（c）的分泌水平。（d）接受不同治疗的小鼠腹股沟淋巴结中激活的DC比值。（e）治疗后组织液中的细胞*性T淋巴细胞比例。（f）接受不同治疗的小鼠的骨髓中活化的B细胞比率。（g）治疗后组织液中的辅助性T细胞。（h）不同治疗小鼠的间质液中激活的中央记忆T细胞比率。（i）脾脏，血液，腹膜液和间质液中的抗4T1抗体滴度。（j）BLAB/c小鼠中肿瘤的生长曲线。（k）在预免疫的BLAB/c小鼠中注射4T1细胞两周后肿瘤的代表性照片。（l）在三周评估期内4T1荷瘤小鼠的体重变化曲线。

在小鼠黑色素瘤以及乳腺癌模型中，SHV与aOX40的联合使用可增强抗肿瘤的免疫反应，提高细胞免疫及免疫记忆效果。使SHV明显抑制了B16和4T1肿瘤的生长，提高了小鼠的生存率(图5，6和7)。

综上，SHV疫苗具有优异的抗原递呈、免疫激活和抗肿瘤效果，并且制备工艺简单，成本低廉，易于大规模生产。从理论上讲，B16和4T1细胞也可用其他任意抗原替代，例如其他肿瘤细胞，病原微生物或单个抗原蛋白等。总之，新型抗肿瘤疫苗SHV具有优良的通用性，便利性和灵活性，可为下一代个性化疫苗的设计带来新思路和新方案。

02

论文第一/通讯作者简介

第一作者：彭文畅

天津大医院级硕士研究生，主要研究方向为多功能新型纳米疫苗研制技术的开发。

通讯作者：郑斌

天津大医院副教授、研究生导师，主要从事材料化学与智能活细胞药物开发方面的研究工作，利用生物材料、基因编辑、光遗传学等手段在肿瘤、感染性疾病和神经退行性疾病中取得了一系列的研究进展。近五年，发表SCI论文25篇，以第一/通讯作者在AdvancedMaterials(IF:27.)，ACSNano(IF:14.58)等国内外顶级期刊上发表研究型SCI论文18篇(中科院一区TOP期刊论文15篇)，累计影响因子＞。

通讯作者：明东

天津大医院教授、博士生导师，国家杰出青年科学基金获得者，国家“万人计划”专家，科技部中青年科技创新领*人才，国务院*府特殊津贴专家，研究方向包括神经工程学、神经传感与成像、神经接口与康复、神经刺激与调控等基础机理与前沿技术。

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资助信息

上述研究工作得到了国家自然科学基金（30999、和）和天津自然科学基金重点项目（19JCZDJC34）的资助。

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原文信息

BinZheng#,*,WenchangPeng#,LinGan,MingmingGuo,ShuchaoWang,Xiao-DongZhangandDongMing*

Sendaivirus-basedimmunoadjuvantinhydrogelvaccineintensity-modulateddendriticcellsactivationforsuppressingtumorigenesis

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BioactiveMaterials是一本高质量英文期刊，目前已经被SCIE、PubMedCentral、Scopus、Embase收录。同时本刊还入选了年中国科技期刊卓越行动计划--“高起点新刊”项目。

年BioactiveMaterials获得第一个影响因子8.，在MaterialsScience，Biomaterials领域排名第二。

位于《年中国科学院文献情报中心期刊分区表》1区，TOP期刊。