单细胞测序文献精读成功的抗PD1肿瘤 [复制链接]

全文概述

抗PD-1免疫检查点阻滞剂可以诱导恶性肿瘤的持续临床反应，但它们如何在体内发挥作用仍然不完全了解。在这里，作者将活体实时成像与单细胞RNA测序分析和小鼠模型相结合，以直接在肿瘤内发现抗PD-1药效学。作者研究表明，有效的抗肿瘤反应需要肿瘤浸润性树突状细胞(DC)的一个子集，该子集会产生白介素12(IL-12)。这些DC不结合抗PD-1，但是在感测从邻近T细胞释放的干扰素γ(IFN-γ)时产生IL-12。DC衍生的IL-12反过来刺激了抗肿瘤T细胞免疫。这些发现表明，抗PD-1完全激活抗肿瘤T细胞不是直接的，而是涉及T细胞-树突状细胞的交互作用。此外，作者发现激活非典型的NF-κB转录

因子途径可使产生IL-12的DC扩增，并使肿瘤对抗PD-1的治疗敏感，从而提出了改善对检查点阻滞反应的治疗策略。

重点/p>

1.有效的抗PD-1抗肿瘤反应需要产生IL-12的树突状细胞2.抗PD-1通过CD8+T细胞产生的IFN-γ间接激活IL-.激动非典型的NF-κB途径可增强树突状细胞IL-12的产生4.将抗PD-1与非典型NF-kB激动剂联合使用可增强检查点免疫治疗

背景介绍

免疫检查点阻滞已成为对抗各种癌症的关键疗法。目前批准的免疫检查点阻断剂是靶向细胞*性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)或程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)通路的单克隆抗体。这些抑制通路很重要，因为它们可以保护宿主免受不受控制的免疫激活，但又可以与肿瘤结合使它们抵抗免疫攻击。例如，浸润肿瘤的细胞*性CD8+T细胞通常会表达PD-1，导致它们对肿瘤无效。因此，aPD-1(抗PD-1)单抗或抗PDL1单抗被设计为拮抗T细胞中的PD-1抑制途径，并增强CD8+T细胞介导的肿瘤破坏。

迄今为止，FDA批准的针对PD-1-PDL1信号轴的疗法，特别是抗PD-1单抗，在临床上已被证明在免疫检查点阻滞疗法中有效。这些药物驱动持续控制肿瘤的能力取决于几个变量，包括CD8+T细胞对肿瘤的浸润、干扰素-γ(IFN-γ)的产生、新抗原丰度、MHCI类表达、CD28共刺激信号、患者微生物群和抗体组成。但是，免疫检查点阻滞剂如何与复杂的肿瘤微环境结合，以及在肿瘤排斥发生期间达成治疗成功的机制的了解仍然有限。

为了解决这些知识空白，作者试图在肿瘤排斥期间以单细胞分辨率追踪体内免疫疗法功能的关键读数，并解释如何实现免疫介导的肿瘤控制。考虑到IFN-γ和白介素12(IL-12)是组织特异性破坏的关键免疫因素，作者使用活体成像来追踪抗PD-1治疗后肿瘤内的这些因素。作为对单细胞成像的补充，作者还使用了单细胞RNA测序(scRNAseq)提供了无偏的整个肿瘤免疫反应微环境免疫治疗反应观察。

主要结果1、成功的抗PD-1治疗可触发肿瘤内源性IFN-γ和IL-12反应

为了将免疫治疗功能的关键读数成像，作者评估了IFN-γ和IL-12p40(IL-12和IL-23的蛋白亚基)，方法是使用IFN-γ-内部核糖体进入位点-*色荧光蛋白(IFN-γ-IRES-YFP)和IL-12p40-IRES-YFP记录小鼠基因，以下分别称为IFN-γ-eYFP和IL-12p40-eYFP。活体内成像检测到YFP，YFP由产生IFN-γ或IL-12p40的细胞表达。作者追踪了抗PD-1治疗敏感的MC38肿瘤细胞的排斥反应期间的体内IFN-γ和IL-12p40，这些细胞被H2B-mApple标记。作者还追踪了巨噬细胞，这些巨噬细胞有太平洋蓝葡聚糖纳米颗粒标记，因为这些细胞通常在肿瘤中很丰富。(图1A)

肿瘤微环境的活体内成像显示单次抗PD-1注射后1天，IFN-γ-eYFP+细胞的扩增范围为6.0±1.1(平均值±SEM)。这种增加在治疗后可持续长达3天，且大部分为CD8+T细胞(图1B)。活体体内成像进一步显示，治疗后第1天，IL-12p40-eYFP+细胞增加了12.1±3.7倍，持续至少5天，它们是DC细胞(图1C)。

与在抗PD-1治疗之前检测到的少数IL-12+细胞相比，治疗后存在的那些细胞聚集在肿瘤的较深区域(图1D和1E)和更靠近血管的区域(图1F)。

实时成像观察证实，IL-12+细胞在肿瘤内蓄积的能力表明这些细胞在抗PD-1处理后1天运动，而在第5天运动的更少了。这些发现表明，将抗PD-1递送至肿瘤会影响至少两个对治疗反应不同的非重叠细胞群:激活IFN-γ信号通路的CD8+T细胞和开启IL-12产生的DC样细胞。(图1G，图1H)

2、scRNAseq显示DC限制的IL-12产量

接下来，作者试图进一步表征抗PD-1诱导的IL-12+DC样细胞。为了对肿瘤免疫微环境的免疫治疗反应提供无偏观察，作者对从未经治疗(n=1,个已测序细胞)或经抗PD-1处理(n=2,个已测序细胞)的肿瘤中分离的CD45+细胞进行了scRNAseq分析。通过t-SNE(图2A)可视化的细胞簇中确定了以下种群:常规T(Tconv)细胞、调节性T(Treg)细胞、自然杀伤细胞(NK)、中性粒细胞(Neu)、单核细胞(Mo)和巨噬细胞(Macs)，以及两个DC子集，分别称为DC1和DC2。

DC1和DC2均表达DC标记Batf3、Flt3、H2-Dmb2和Zbtb46;DC1表达Fscn1和Ly75(DEC-);DC2s表达CDa(DC-SIGN)、Mgl2(CDb)和Cd24a(图2B)。

两个DC子集对巨噬细胞集落刺激因子受体Csf1r均为阴性(图2C)，与DC2s相比，DC1s的粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子受体Csf2rb的表达更高，DC1s和DC2s均未表达粒细胞集落刺激因子受体Csf3r(图2C)。

此外，DC1富含T细胞共刺激因子Cd80、Cd83、Cd86和Icam1(图2D)，并且DC1s和DC2s表达不同的趋化因子和趋化因子受体(图2E)。IL-12p40(也称为IL12b)表达仅包含在DC1群体中(图2F)。

作者还发现用于调控IL-12信号传导和合成的调控基因中，DC1富含IL-12相关的生产因子，例如Cd40和Irf8(图2G)。

scRNAseq分析证实抗PD-1处理后IL-12+DC存在扩增(图S2E)。总体而言，这些数据表明在肿瘤微环境中有大量产生IL-12的DC。

3、DC和IL-12与抗PD-1治疗有关

为了评估DC是否与抗PD-1治疗相关，作者生成了Zbtb46-DTR骨髓嵌合体，这使作者可以选择性地消耗DC，并在肿瘤形成后抗PD-1治疗前进行消耗。缺乏DC的小鼠无法响应抗PD-1排斥肿瘤(图2H)，表明在抗PD-1介导的肿瘤排斥发生时需要这些细胞。

为了确定IL-12是否有助于抗PD-1的治疗功效，作者研究了在存在和不存在IL-12单抗的情况下接受抗PD-1的DC充足的MC38荷瘤小鼠。IL-12被中和的小鼠无法排斥肿瘤，表明抗PD-1治疗后IL-12的产生对于实现肿瘤控制是必要的(图2I)。

总体而言，这些数据表明，抗PD-1处理可诱导DC产生IL-12，而DC和IL-12均严格调节抗PD-1的治疗效力。该结果与先前的发现一致，即肿瘤浸润的DC可以促进T细胞免疫和免疫治疗反应，在这里作者显示DC通过为肿瘤免疫微环境提供细胞因子支持来辅助抗肿瘤反应。

4、DCs感应IFN-γ的过程可以控制IL-12的产生

为了确定抗PD-1处理如何激活DC，作者首先研究抗体是否直接结合这些细胞。研究已证实一些髓样细胞表达PD-1，但是，流式细胞仪和scRNAseq分析均表明IL-12+DC在转录水平(图S2A)和蛋白质水平(图3A)上均不表达PD-1受体。

在MC38荷瘤IL-12基因实验小鼠中通过活体成像追踪药物的药代动力学时，作者证实抗PD-1给药24小时后，肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)中有抗PD-1积累，但IL-12+DC中没有抗PD-1积累(图3B)。

根据这些数据，作者得出结论，抗PD-1不可能直接结合并激活IL-12+DC。由于抗PD-1mAb与肿瘤浸润的CD8+T细胞物理结合，作者假设这些细胞一旦被抗PD-1激活，便可以促进DC分泌IL-12。为了解决这种可能性，作者在注射抗PD-1之前使用活体成像技术追踪了CD8+T细胞衰竭的小鼠中IL-12的表达。作者发现CD8+T细胞的缺乏会减少IL-12的产生(图3C)。

作者进一步推断，IFN-γ可以介导DC产生IL-12，因为该细胞因子是由抗PD-1激活的CD8+T细胞产生的(图1B)，并且可以增强IL-12的反应。为了验证该假设，作者评估了在抗PD-1治疗期间中和了IFN-γ的小鼠。作者发现，阻滞IFN-γ降低了肿瘤微环境中IL-12的产生(图3D)，这种结果由DC产生的IL-12减少和IL-12+DC的数量减少共同促成。因此，阻滞IFN-γ就阻止了抗PD-1介导的抗肿瘤效应。

以上结果表明DC对IFN-γ的感应促进了IL-12的产生并导致了对肿瘤的控制。为了直接检验该假设，作者通过将Itgax-cre与Ifngr1fl/fl小鼠杂交来消除DC对IFN-γ的感应。这些小鼠的肿瘤显示IL-12p40产生受损(图3E)，并且对抗PD-1治疗无反应(图3F)，从而强调了在抗PD-1疗法期间DC和其他可能表达CD11的细胞对IFN-γ的重要性。综上，作者发现了一种对DC的间接抗PD-1效应;这种作用是通过IFN-γ

介导的，对于IL-12的诱导和其治疗反应至关重要。

5、IL-12激活小鼠的肿瘤浸润淋巴细胞效应功能

接下来，作者检查了肿瘤微环境中IL-12产生的后续影响。最初，作者使用活体显微镜检查来评估重组IL-12对IFN-γ实验基因小鼠(在无抗PD-1的情况下)的肿瘤的作用。作者发现肿瘤内IL-12基本上扩增了IFN-γ-eYFP+细胞(到第4天增加5.9-±0.7倍;图4A)。与先前的报道一致，将IL-12应用于MC38肿瘤细胞后产生了很强的抗肿瘤应答(图4B)。

为进一步测试IL-12是否可以激活肿瘤浸润的CD8+,作者直接从T细胞中分离出MC38肿瘤中的这些细胞，并分别在有和没有IL-12的情况下对它们进行aCD3/CD28刺激。在存在IL-12的情况下，受刺激的CD8+T细胞产生IFN-γ显着增加(图4C)，表明肿瘤浸润性T细胞可以直接对IL-12产生反应。T细胞共刺激和IL-12达到最大IFN-γ反应的需求可能反映了CD28挽救衰竭CD8+T细胞的需要，也可能反映了PD-1在限制CD28介导的共刺激中的作用。

6、IL-12激活癌症患者的肿瘤浸润淋巴细胞效应功能

接下来，作者使用两个临床队列研究了IL-12对癌症患者的后续影响。首先，为了评估IL-12在肿瘤内的作用，作者从19种黑色素瘤患者的皮肤活检样本中收集了使用电穿孔方法的样本，该方法可以将质粒IL-12直接递送至肿瘤。治疗前后样品的比较显示，IL-12递送增强了肿瘤内核心溶细胞基因的表达(图5A和5B)。这些基因，即CD2、CD3E、CD、GZMA、GZMH、GZMK、NKG7和PRF1与免疫编辑和抗肿瘤免疫反应有关，富含这些基因的肿瘤更有可能对抗PD-1免疫疗法作出反应。

因此，作者在这些患者中观察到增强的溶细胞基因标记与治疗反应之间呈正相关(图5C)。

要确定IL-12是否可直接激活从这些细胞分离的人类肿瘤浸润性CD8+T细胞，作者从六个癌症患者收集新鲜肿瘤组织，其中包括两例肺腺癌、三种肺鳞状细胞癌和一个滑膜肉瘤。从所有肿瘤离体纯化CD8+T细胞，并分别在有和没有IL-12的情况下进行aCD3刺激。在其中五位患者中，IL-12的存在增加了CD8+T细胞产生IFN-γ的(图5D)。总的来说，这些患者数据概括了作者在小鼠中的观察结果，即IL-12可以直接刺激肿瘤浸润性T细胞的抗肿瘤活性，且肿瘤内CD8+T细胞的活化对于抗肿瘤活性至关重要。

7、非典型性NF-κB途径的激活会使产生IL-12的DC扩增

考虑到IL-12许可抗肿瘤T细胞免疫的能力，作者进一步研究激动产生IL-12的细胞是否可以增强对抗PD-1治疗的反应。考虑到非典型的NF-κB通路与引发细胞*性T细胞的相关性，作者研究了非典型的NF-κB通路，并且发现关键的非典型NF-κB通路基因，即CD40、BIRC2(CIAP1)、MAP3K14(Nik)、NFKB2(P)和RELB，都在肿瘤浸润性IL-12+DC子集中选择性地上调(图6A)。

作者试图以两种不同的方式激活非经典的NF-κB途径:使用先前已显示出抗肿瘤活性的激动性CD40mA或使用靶向小分子抑制剂AZD细胞凋亡蛋白抑制剂(cIAP)。接下来，用荧光染料标记激动性aCD40单抗，并在IL-12实验基因小鼠的肿瘤内通过活体显微镜进行追踪。这种成像方法不仅显示了该药物在体内与IL-12+肿瘤浸润细胞以及某些巨噬细胞直接相互作用的能力(图6B)，还进一步确定了该治疗诱导肿瘤浸润的IL-12+细胞增加了6.6-±1.2倍(图6C)。

流式细胞仪测量表明IL-12是由DC产生的，而并非由TAM产生的(图6D和6E)。这些发现与以前的证据相符，即aCD40治疗依赖于依赖Batf3的DC，尽管在某些情况下巨噬细胞也可以促进aCD40治疗但这可能独立于IL-12。

8、IL-12+DC以依赖IL-12的方式扩增并改善癌症免疫治疗预后

已发现激动性CD40单抗(aCD40)的抗肿瘤活性依赖于IFN-γ。作者评估了aCD40实验动物中的IFN-γ，并且确实发现aCD40治疗有效地增强了肿瘤内IFN-γ水平(图7A)。此外，用激动性aCD40单抗或AZD治疗可在体内提供抗肿瘤作用(图7B)。为了测试用aCD40或AZD处理后IL-12的相关性，作者比较了它们在MC38荷瘤小鼠中的作用，该小鼠经或未经IL-12中和单克隆抗体处理。这些研究表明，IL-12诱导是这些治疗的主要机制，因为接受IL-12中和mAb的动物失去了肿瘤控制能力(图7B)。综上所述，这些数据将非典型NF-κB通路与抗肿瘤内DC和抗PD-1的治疗功效联系在一起，并表明靶向非典型的NF-κB成分可以治疗癌症。

接下来，作者定义了激动性IL-12+细胞是否可以增强对抗PD-1治疗的反应。为此，作者评估了用拮抗剂抗PD-1、激动剂aCD40或两者治疗的小鼠的MC38肿瘤进展。作者发现单一疗法不能完全控制肿瘤的生长，而联合治疗在大多数接受治疗的动物中产生了完整、持久的反应(图7C)。

因为MC38肿瘤模型对抗PD-1单一疗法有反应(尽管不完全)，所以作者也测试了抗抗PD-1治疗的B16F10黑色素瘤模型。作者发现，与抗PD-1或aCD40单一疗法相比，将抗PD-1与aCD40mAb结合可控制B16F10肿瘤的生长并使小鼠存活率提高(图7D)。联合治疗可抑制50%(12只中的6只)小鼠的肿瘤;这些小鼠抵抗了继发性肿瘤攻击(图7E)，表明该治疗触发了该模型中的抗肿瘤记忆。

考虑到给予携带B16F10黑色素瘤的小鼠的重组IL-12也产生了显着的抗肿瘤作用(图7F)，作者测试了抗PD-1+aCD40治疗组合是否依赖IL-12的活性。作者分别在存在和不存在IL-12中和mAb的情况下，对B16F10小鼠进行了联合免疫治疗，发现阻滞IL-12信号传导阻止了联合治疗的治疗活性(图7G)。这些数据表明DC靶向可以以IL-12依赖性方式增强免疫疗法的效力并使肿瘤对抗PD-1治疗敏感。

全文总结

1、成功的抗PD-1治疗可触发肿瘤内源性IFN-γ和IL-12反应2、scRNAseq显示DC限制的IL-12产量3、DC和IL-12与抗PD-1治疗有关4、DCs感应IFN-γ的过程可以控制IL-12的产生5、IL-12激活小鼠的肿瘤浸润淋巴细胞效应功能6、IL-12激活癌症患者的肿瘤浸润淋巴细胞效应功能7、非典型性NF-κB途径的激活会使产生IL-12的DC扩增8、IL-12+DC以依赖IL-12的方式扩增并改善癌症免疫治疗预后

作者使用单细胞分辨率读数，包括活体显微镜检查和scRNAseq，来研究肿瘤内的癌症免疫疗法药效学，并更好地定义体内肿瘤排斥的机制。作者发现抗肿瘤细胞因子IFN-γ和IL-12是通过免疫疗法相互诱导的，并且进一步区分了激活这些相应细胞因子的直接和间接机制。原则上，作者确定抗PD-1通过激活的T细胞直接诱导IFN-γ的产生，但通过一部分肿瘤内DC间接诱导IL-12的产生。IL-12的产生需要DC感应IFN-γ，进而需要获得许可的效应T细胞反应在小鼠和癌症患者中。作者还发现，产生IL-12的DC富含非典型的NF-κB信号通路成分，即关键的非典型NF-κB激酶NIK是抗PD-1应答所必需的，并且在治疗环境中非典型NF-κB通路的激动作用产生了IL-12依赖性抗肿瘤应答。此外，通过非典型的NF-κB激动与抗PD-1治疗结合触发T细胞-DC信号交叉可以有效增强抗肿瘤免疫力。

进一步研究/p>

1.通过加强合理的药物组合来改善免疫疗法反应，这种药物组合可以增强淋巴样和髓样免疫区域之间的信号交叉。

2.进一步研究细胞对IL-12的应答可能会发现逆转T细胞衰竭并增强抗肿瘤免疫力的其他通路。

3.进一步的临床研究应测试合理设计的强调“T细胞-DC串扰信号交叉”的治疗策略是否可以增强消除肿瘤的积极反馈机制并扩大对免疫疗法敏感的癌症的比例。