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抑制B7H3免疫检查点能增强细胞毒 [复制链接]

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介绍

B7-H3(CD)是B7超家族分子之一。在小鼠中,B7-H3在专职抗原呈递细胞(APC)上组成型表达,并在用脂多糖(LPS)激活后在DC上上调。使用B7-H3-Ig融合蛋白描述了B7-H3共抑制功能,在该蛋白中它减少了增殖,并减少了由抗CD3。此外,B7-H3基因缺失或用抗体阻断可增强实验性自身免疫性脑脊髓炎。在人类中,B7-H3首次在DC中被报道为阳性共刺激剂,可在T细胞激活期间增强IFN-γ的产生。然而,最近的一项研究表明,在T细胞活化过程中可以有效抑制IFN-γ、IL-2、IL-10和IL-13的产生。到目前为止,B7-H3的受体还没有被鉴定出来。

在癌症患者中,B7-H3表达以前被确定为不良预后因素。例如,非小细胞肺癌患者的B7-H3表达与晚期肿瘤分期、肿瘤大小和淋巴结转移有关。在癌症中,肿瘤中B7-H3的表达与较短的存活时间和较高的癌症复发率相关。尽管这些和其他研究暗示B7-H3在人类癌症中的作用,但B7-H3在癌症中的功能的潜在机制仍不清楚。

在当前的研究中,我们分析了B7-H3在小鼠癌症模型中的作用。我们发现B7-H3在小鼠和人类肿瘤的肿瘤微环境中表达。B7-H3抑制控制的肿瘤生长和抗肿瘤免疫依赖于CD8+T细胞和自然杀伤(NK)细胞。此外,B7-H3直接抑制NK细胞的活化。因此,B7-H3作为肿瘤免疫的关键负调节因子,原则上可以作为癌症免疫治疗的靶点。

实验思路介绍

首先考察B7-H3及其受体在人和鼠肿瘤中的表达

作为分析B7-H3在癌症免疫学中的作用的第一步,我们确定了B7-H3在癌症患者中的表达。癌症基因组图谱(TCGA)数据的分析显示,与匹配的正常组织相比,B7-H3的转录本在多种类型的肿瘤中上调。

我们还测试了肝细胞癌(HCC)或黑色素瘤患者活检组织中B7-H3的mRNA和蛋白质水平。在HCC患者中,肿瘤中的APCs具有甚至比正常肝脏或肿瘤旁区域更高的B7-H3表达。我们还确定了从切除的肿瘤获得的人黑色素瘤细胞系中B7-H3的表达(图1A)。尽管在体外培养的黑色素瘤细胞系和DC中发现了不同水平的B7-H3mRNA表达(图1B),但B7-H3蛋白在这些细胞上同样高度表达(图1C)。更重要的是,在源自人类黑色素瘤浸润的巨噬细胞和DC上发现了B7-H3的蛋白质表达(图1D)。

为了评估B7-H3受体在HCC患者中的表达,我们测试了人B7-H3-小鼠IgG2a融合蛋白与外周血单核细胞、正常肝脏、副肿瘤和肿瘤中淋巴细胞的结合。我们观察到与外周血相比,肝脏中CD4+和CD8+T细胞上B7-H3受体的表达增加。

肿瘤细胞的B7-H3表达、肿瘤浸润性APC和淋巴细胞的B7-H3受体表达强烈表明它们在肿瘤微环境中的调节作用。

图1B7-H3在人和鼠肿瘤中的表达。

下一步了解B7-H3在鼠肿瘤中的功能。我们使用了我们之前生成的抗B7-H3抗体来检查B7-H3的表达。令人惊讶的是,我们在小鼠E.G7淋巴瘤和B16-F10黑色素瘤细胞中都发现了细胞内B7-H3,但在它们的表面没有发现(图1E)。在这些细胞中也发现了B7-H3mRNA的表达,排除了细胞内染色中交叉反应的可能性(图1F)。有趣的是,在同基因小鼠中接种7天后,B7-H3在E.G7和B16-F10肿瘤细胞的表面高度表达(图1G),表明其表面表达可以由肿瘤微环境诱导。

MOPC骨髓瘤细胞具有细胞表面和细胞内B7-H3,而A20淋巴瘤细胞仅显示其细胞内表达(图1E)。除了在肿瘤细胞中表达外,B7-H3还存在于E.G7和B16模型中肿瘤浸润巨噬细胞和DC的表面(图1G)。

来自TIL和脾细胞(SPL)的NK和CD8+T细胞都被小鼠B7-H3-Ig蛋白强烈结合。相比之下,CD4+T细胞不与B7-H3-Ig结合。与E.G7肿瘤类似,来自B16-F10黑色素瘤的NK细胞也与B7-H3-Ig结合。这些结果表明B7-H3可能作用于NK和CD8+T细胞。

下一步,研究B7-H3对肿瘤的抑制作用

为了研究B7-H3在肿瘤发展中的作用,在C57BL/6背景下的B7-H3缺陷型(KO)13和野生型(WT)小鼠皮下注射E.G7细胞,肿瘤生长评估3周。与WT小鼠相比,缺乏B7-H3使E.G7细胞的生长显着降低至约50%(图2A)。这些数据表明抑制B7-H3可以增强抗肿瘤免疫。因此,我们使用抗B7-H3阻断抗体检查了B7-H3阻断在多个移植造血肿瘤中的治疗效果。在第1天接受活肿瘤细胞的同基因小鼠(A20静脉注射,E.G7和MOPC细胞皮下注射)在第3天用抗B7-H3抗体处理,然后每隔一天注射10次。抗B7-H3治疗显着减少了携带E.G7或MOPC的小鼠的肿瘤生长,并将30%的A20小鼠的存活率延长了至少1个月(图2B-2D)。有趣的是,抗B7-H3处理的B7-H3KO小鼠的肿瘤生长与B7-H3KO小鼠相似(图2A),表明宿主免疫细胞的B7-H3表达更重要,也表明抗体确实不通过抗体依赖性细胞*性(ADCC)消耗肿瘤细胞。

图2B7-H3抑制可减少多种癌症模型中的肿瘤发展。

由于在人和鼠黑色素瘤中观察到B7-H3表达,我们还评估了B7-H3KO小鼠中B16-F10黑色素瘤的发展。将肿瘤细胞静脉注射到小鼠体内以促进肺部黑色素瘤集落的生长。攻击后14天,B7-H3KO小鼠仅表现出WT小鼠中发现的集落的1/3至1/10(图2E)。同样,用抗B7-H3阻断抗体治疗作为治疗方案减少了肺中B16-F10的生长;与用大鼠IgG治疗的小鼠相比,在用抗B7-H3治疗的小鼠中形成的肿瘤病灶尺寸更小(图2F)。总之,我们对造血和非造血肿瘤模型的结果表明B7-H3在来自不同组织来源的多种肿瘤发展中的重要作用。

研究B7-H3介导的肿瘤免疫的途径

为了了解B7-H3在肿瘤发展中的功能机制,我们检查了肿瘤浸润免疫细胞以及来自携E.G7肿瘤的B7-H3KO或WT小鼠的SPL。与对照组相比,B7-H3KO小鼠或用抗B7-H3治疗的小鼠的脾脏和肿瘤中的CD11b+Gr1+细胞减少。然而,同样为Ki-67阳性的调节性T细胞群在B7-H3KO和WT小鼠的脾脏和肿瘤中没有显示差异。

为了确定我们的肿瘤模型中B7-H3的功能靶细胞,在用E.G7肿瘤进行攻击之前,使用选择性mAb去除CD4+、CD8+或NK细胞。

有趣的是,在B7-H3KO小鼠中,NK细胞或CD8+T细胞的消耗极大地阻止了对肿瘤生长的控制。NK和CD8+T细胞的双重消耗进一步消除了对B7-H3KO小鼠肿瘤生长的抑制。相比之下,CD4+T细胞的消耗不影响B7-H3KO小鼠的肿瘤生长(图3A-3B)。

我们还证实,NK细胞或CD8+T细胞的消耗降低了抗B7-H3Ab治疗的抗肿瘤作用。此外,消耗了CD8+T和NK细胞的小鼠比单次消耗的小鼠发展出更大的肿瘤。同样,在B16-F10黑色素瘤模型中,B7-H3KO小鼠中NK细胞的消耗增加了肿瘤病灶的数量(图3C)。

然而,CD8+T细胞的消耗对B7-H3KO小鼠的肺转移没有任何影响,这与B16-F10诱导CD8+T细胞反应的能力较差一致。有趣的是,当使用B16-OVA系时,CD8+T细胞在B7-H3抑制介导的肿瘤减少中变得重要(图3D)。

总之,这些结果表明由B7-H3抑制产生的抗肿瘤免疫依赖于CD8+T细胞,尤其是NK细胞。

图3B7-H3抑制的抗肿瘤作用取决于CD8+T和NK细胞。

B7-H3调节抗肿瘤CD8+T细胞

当对TIL进行表型评估时,CD4+和CD8+T细胞的比例在B7-H3KO小鼠的肿瘤中没有变化(图4A)。由于E.G7肿瘤表达卵清蛋白(OVA)抗原,我们评估了来自TIL的OVA反应性CD8+T细胞。与WT小鼠相比,来自B7-H3KO小鼠的肿瘤中SIINFEKL四聚体阳性细胞增加了一倍(图4B)。

进一步的分析表明,这些CD8+T细胞表达水平增加的IFN-γ和颗粒酶B。在B7-H3缺陷小鼠中,IFN-γ+和颗粒酶B+CD4+TIL的百分比也增加(图4C)。有趣的是,NK细胞的消耗显着减少了TIL中表达颗粒酶B的CD8+T细胞,而CD8+T细胞的消耗减少了B7-H3缺陷小鼠中肿瘤浸润NK细胞对颗粒酶B的表达(图4D)。此外,与WT小鼠的细胞相比,B7-H3KO小鼠肿瘤组织中的CD8+T细胞和NK细胞降低了PD-1的表达(图4E)。

我们还测试了B7-H3在DC和CD8+T细胞体外共培养中是否抑制CD8+T细胞活化。来自WT或B7-H3KO小鼠的脾DCs被分离出来,并与CFSE标记的OVA特异性CD8+T细胞(OT-I)在体外共培养3天,并通过稀释CFSE强度来评估增殖。与来自WT小鼠的DC相比,来自B7-H3KO小鼠的DC诱导OT-IT细胞增殖增加。更重要的是,与来自WT小鼠的DCs刺激的那些相比,来自B7-H3KO小鼠的DCs刺激的OT-IT细胞显示出明显更高的颗粒酶B和IFN-γ表达。

因此,B7-H3抑制可能会增强肿瘤抗原特异性CD8+T细胞的数量和细胞溶解功能。

图4B7-H3调节肿瘤浸润CD8+T细胞。

B7-H3调节NK细胞功能

为了了解B7-H3在调节NK细胞介导的肿瘤保护中的作用,我们分析了在WT或B7-H3缺陷宿主小鼠中发育的E.G7或B16.F10肿瘤中NK细胞的数量和功能。B7-H3KO小鼠中NK细胞的百分比和绝对数量增加。

此外,B7-H3KO小鼠在来自E.G7和B16.F10小鼠的TIL中显示出产生颗粒酶B的NK细胞显着增加(图5A-5B)。CD69是一种NK激活标记物,在来自B7-H3KO小鼠的脾脏和肿瘤中的NK细胞上上调。为了确定B7-H3对NK杀伤功能的调节,从携带E.G7的小鼠的脾脏和TIL中分离出NK细胞,并通过检测caspase-的裂解水平在体外测试了E.G7细胞的杀伤作用。与来自对照小鼠的NK细胞相比,来自B7-H3KO小鼠的NK胞在杀死肿瘤方面更有效(增加两倍)(图5E)。

这些结果表明B7-H3控制肿瘤微环境中的NK细胞活化。由于B7-H3由DC表达,我们测试了源自B7-H3KO小鼠的DC在体外是否可以更有效地诱导NK细胞活化。从WT或B7-H3KO小鼠中分离的DCs在与NK细胞共培养之前用LPS刺激18小时。用DC激活过夜后,使用基于Caspase3的测定评估NK细胞对YAC-1细胞的杀伤。来自B7-H3KO小鼠的DCs诱导了比WTDCs更强的NK介导的杀伤活性(图5D),因此支持B7-H3在抑制NK细胞活化中的作用。

图5B7-H3抑制增加NK细胞功能。

摸索抗B7-H3和抗PD-1联合治疗的效果

根据我们的数据,B7-H3似乎应该是针对淋巴瘤和黑色素瘤的免疫治疗的良好靶点,因为用特异性抗体阻断B7-H3会诱导抗肿瘤免疫。由于B7-H3和PD-L1在E.G7模型和人类癌症中表达,我们决定在PD-1阻断的背景下测试B7-H3的阻断,这已经显示出显着的抗肿瘤作用在人类癌症中。

C57BL/6小鼠组皮下移植1×E.G7细胞,腹腔注射对照、抗B7-H3抗体、抗PD-1抗体或抗B7-H3加抗PD-分别在第7、10、13、16和19天分别产生1种抗体。

尽管用抗B7-H3或PD-1的单一抗体治疗表现出抗肿瘤作用,但联合抗B7-H3和抗PD-1抗体治疗进一步减少了肿瘤体积和肿瘤重量(图6A)。

相比之下,从第3天开始的早期联合阻断治疗没有显示协同效应,因为单一抗体治疗已经有效(图6B)。因此,抗B7-H3和抗PD-1联合治疗可以产生强大的抗肿瘤免疫力,尤其是在晚期癌症中。

图6通过B7-H3和PD-1双重阻断增强保护作用。

总结

本文的数据强烈支持B7-H3在肿瘤免疫中的作用,并表明单独或与PD-1一起靶向B7-H3检查点作为针对癌症的新免疫疗法具有潜在价值。

参考文献:InhibitionoftheB7-H3immunecheckpointlimitstumorgrowthbyenhancingcytotoxiclymphocytefunction,doi:10./cr..90

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