CAR转导的自然杀伤细胞NKcell [复制链接]

CAR转导的自然杀伤细胞（NKcell）在CD19阳性淋巴样肿瘤中的应用

细胞治疗领域自CAR工程出现以来，其指导范式发生了转变。CAR工程可以重定向免疫效应细胞的特异性，将其转化为对抗癌细胞的更有效武器。癌症的细胞治疗领域正以前所未有的速度增长，尤其是自嵌合抗原受体CAR-T细胞出现以来。CD19-CART细胞是FDA批准的第一种基于CART细胞的药物。开发CAR-T细胞用于治疗其他类型的肿瘤(包括实体瘤)的研究正在增加。然而，有报道称，临床上与CART细胞治疗相关的严重副作用包括细胞因子释放综合征(CRS)、“靶点上、肿瘤外”*性、神经系统症状、移植物抗宿主病(GvHD)(如果在异基因环境中使用)和肿瘤溶解综合征。其他研究也表明，由CART细胞引起的CRS可能危及生命。此外，CART细胞不仅可以攻击肿瘤细胞，还可以攻击正常细胞，从而产生靶向的、非肿瘤的*性。例如，HER2特异性CART治疗导致转移性结肠癌患者急性呼吸衰竭和死亡，可能是由于HER2/neu在肺实质或血管中表达水平低。CD19-CART细胞治疗也有严重的神经*性，如急性脑水肿，在最初出现神经症状几小时后导致脑死亡。从同种异体来源获得的CART细胞也可能导致移植物抗宿主病。禁用内源性TCR有可能避免或降低GvHD风险。禁用内源性TCR可以通过最近的技术如CRISPR/CAS9、TALEN、锌指核酸内切酶和使用一系列蛋白质的受体阻断剂。

与T细胞相比，NK细胞为癌症免疫治疗提供了许多优势。有报道与同种异体T细胞相比，同种异体NK细胞不需要完全HLA匹配，其引起的GvHD很少或没有GvHD。事实上，有动物实验数据显示，NK细胞不仅不会引起GvHD，在某些情况下还可通过抑制活化的同种异体反应性T细胞，同时保留移植物抗肿瘤效应来预防GvHD。相反，CART细胞可导致GvHD，即使HLA相合的轻微错配仍可能具有激发作用。此外，NK细胞在循环中的寿命有限，除一些病*外，不产生记忆细胞。因此，基于原代NK细胞的CAR方法可能不需要修改，以纳入自杀基因作为安全性转换。使用CARNK细胞的优势在于，与CAR-T细胞不同，其可来源于脐带血(UCB)或细胞系（如NK-92），二者均有可能用作“现成”治疗产品。

近日，休斯顿德克萨斯大学安德森癌症中心刘恩利博士课题组在TheNewEnglandJournalOfMedicine杂志上发表了题为：UseofCAR-TransducedNaturalKillerCells

inCD19-PositiveLymphoidTumors的研究论文，该研究提供了强有力的证据表明，经过修饰表达抗CD19CAR的自然杀伤（NK）细胞治疗复发或难治性CD19阳性淋巴样肿瘤的安全性和有效性。

为了在临床试验中利用自然杀伤细胞的抗肿瘤潜力，此研究使用了一种逆转录病*载体，该载体表达编码抗CD19CAR、IL-15的基因，以增强转导的自然杀伤细胞的体内扩增和持久性，并在出现不可接受的*性作用时诱导半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9，以触发抗CD19CAR的自然杀伤细胞的凋亡。在小鼠淋巴瘤的临床前模型中，从脐带血中获得并经抗CD19CAR转导的自然杀伤细胞，IL-15和诱导型半胱天冬酶9比非诱导型对照自然杀伤细胞具有更好的抗肿瘤活性。

接下来，根据这些发现，进行了一项1期和2期试验，以评估逐步增加剂量的自然杀伤细胞治疗复发或难治性CD19阳性癌症的安全性和有效性。在这项1期和2期试验中，对11例复发或难治性CD19阳性癌症（非霍奇金淋巴瘤或慢性淋巴细胞白血病[CLL]）患者给予了来源于脐带血的HLA不匹配的抗CD19CAR-NK细胞。用表达编码抗CD19CAR、白细胞介素-15和可诱导半胱天冬酶9基因的逆转录病*载体转导NK细胞，作为安全性开关。体外扩增细胞，患者接受氟达拉滨(每平方米体表面积30mg)和环磷酰胺(每平方米体表面积mg)去淋巴化疗，连续3天，以3种剂量（每千克体重1×、1×或1×个CAR-NK细胞）之一单次输注给药。在第30天评估后，根据治疗医生的判断，允许进行缓解后治疗。

前9名患者接受的CAR-NK产品与受体的HLA型部分匹配(在HLAA、B和DRβ1位点的6个匹配中有4个匹配)。在患者10和11的治疗中，则不考虑HLA配型。选择了杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)配体错配的脐带血单位用于生产CAR-NK。(捐赠者和接受者之间的KIR不匹配可能会通过一种被称为缺失自我识别的过程来增强NK细胞固有的(非CAR介导的)抗肿瘤活性。)

11例患者的特征

研究结果表明，CAR-NK细胞给药与细胞因子释放综合征、神经*性或移植物抗宿主病的发生无关，并且炎性细胞因子（包括白细胞介素-6）的水平与基线相比没有增加。未达到最大耐受剂量。在接受治疗的11例患者中，8例(73%)有反应；在这些患者中，7例（4例淋巴瘤和3例CLL）完全缓解，1例Richter转化成分缓解但CLL持续。在所有剂量水平下，均在输注后30天内观察到快速缓解。输注的CAR-NK细胞扩增并持续低水平至少12个月。

首先，结果说明了CAR-NK细胞治疗的安全性。输注CAR-NK细胞后，所有患者均未出现细胞因子释放综合征、神经*性或噬血细胞淋巴组织细胞增多症的症状。此外，没有观察到任何移植物抗宿主病的病例，尽管患者与其使用的CAR-NK产品之间存在HLA不匹配。未发现肿瘤溶解综合征或3级或4级非血液*性。未达到CAR-NK细胞的最大耐受量。所有患者都有短暂和可逆的血液*性事件，主要与淋巴清除化疗有关。不能确定输注CAR-NK细胞是否与血液学*性有关。

其次是CAR-NK细胞治疗效果。对11名患者平均随访13.8个月(2.8~20.0个月)，8名患者(73%)有客观反应，其中7名患者(3名CLL患者和4名淋巴瘤患者)完全有效。所有8例患者中，治疗反应发生于输液后的第一个月。在接受治疗的11名患者中，5名接受了KIR配体不匹配的产物。在此研究中，无法评估KIR配体不匹配对结果的影响。在8名对CAR-NK治疗有反应的患者中，5名患者接受了缓解后治疗。患者在CAR-NK治疗后接受造血干细胞移植，完全有效。所有患者在最后一次评估的日期都还存活，完全缓解，尽管患者3、5和7在微小残留病方面仍然有阳性结果。

最后，结果还显示了CAR-NK细胞输注后的持久性。在11例复发或难治性CD19阳性癌症患者中，大多数患者对CAR-NK细胞治疗有反应，未出现重大*性作用。使用实时定量聚合酶链反应检测CAR-NK细胞在体内的扩增，根据每微克基因组DNA的载体转基因拷贝数来测量CAR-NK细胞的体内扩增。输注后3天就可以看到细胞扩增，CAR-NK细胞持续至少12个月。CAR-NK拷贝数峰值在输注后3~14d出现，且呈剂量依赖性。在第14天以后，在外周血液转录物水平或CAR-NK细胞的持续性方面没有发现与剂量相关的差异。据报道，在接受CAR-T细胞治疗的患者中，对治疗有反应的患者的CAR-NK细胞早期扩增明显高于那些没有反应的患者。没有观察到CAR-NK细胞的持久性根据HLA与受体不匹配程度的不同而不同。

在有淋巴结样本的2例患者中，淋巴结中发现的CAR-NK细胞多于骨髓或外周血中的CAR-NK细胞，这一发现支持了CAR-NK细胞集中在疾病部位的观点。在可获得样本的10名患者的骨髓和外周血中也检测到相似水平的CAR-NK细胞。

对一系列外周血液样本的上清液进行了炎性细胞因子和白细胞介素-15(IL-15)的检测。观察到炎性细胞因子(如白细胞介素-6和肿瘤坏死因子α)水平与基线水平相比没有增加，也没有发现全身白细胞介素-15水平比治疗前增加，这表明白细胞介素-15在输液后没有被外周血中的CAR-NK细胞释放到实质的全身水平。

所有患者均接受HLA配型不合的CARNK产品治疗。患者1到9接受了6个HLA分子中4个部分匹配的产品，而患者10和11接受了非HLA匹配的CAR-NK细胞。因此，监测了供者特异性HLA抗体的诱导。在进行检测的所有时间点，没有观察到针对输注产品的不匹配HLA等位基因的抗体诱导。

11名研究患者的不良反应

CAR-NK疗法和缓解后治疗的临床疗效

CAR-NK细胞输注后的持久性

该研究通过将NK细胞被设计成表达抗CD19CAR、白细胞介素-15和诱导的caspase9，在多次复发或难治性CLL或非霍奇金淋巴瘤的深度预处理患者中进行了测试。在平均13.8个月的随访中，11名接受治疗的患者中有8名(73%)有客观疗效。(5名CLL淋巴瘤患者中的4名和6名非霍奇金淋巴瘤患者中的4名)；11名患者中有7名(64%)完全缓解。所有剂量水平的反应都很迅速。由于其他疗法的使用，反应持续时间无法评估，最早在输注后30天开始。

过继免疫疗法后，非工程化NK细胞通常在输注后2周消失，这一特性限制了其临床应用。尽管输注的自然杀伤细胞和受体之间存在明显的人类白细胞抗原不匹配，但输注的自然杀伤细胞有所扩增，并在至少12个月的时间内保持在低水平。构建体中包含的IL-15可能在这些细胞的持久性和抗肿瘤活性中发挥了重要作用。据报道，持续体外暴露于外源性白细胞介素-15可诱导NK细胞耗竭，此研究的临床前数据显示构建体中的白细胞介素-15并未导致CAR-NK细胞耗竭，而是增加了其抗肿瘤活性。

受体对CAR-NK细胞无排斥反应可能是由多种因素引起的。在本次研究中，HLA不匹配的CAR-NK细胞的长期持久性可能是由淋巴去除创造的允许环境和IL-15的异位表达所介导的。然而，这些持久性细胞不足以防止复发。

接受抗CD19CART细胞治疗的患者中有一部分随后复发，CLL患者的1年无进展存活率约为30%，非霍奇金淋巴瘤患者的1年无进展存活率约为45%。鉴于这些结果，此研究允许根据治疗医生的判断使用免疫调节剂、抗癌药或造血干细胞移植进行缓解巩固治疗。然而，在这项研究中，缓解后治疗的使用限制了对CAR-NK治疗后反应持久性的评估。

同种异体CAR-NK细胞可以过继转移，而不会出现与CART细胞治疗相关的严重细胞因子释放综合征和神经*性效应。然而，观察到了高度的一过性骨髓*性，将其归因于淋巴耗竭化疗。无法评估CAR-NK细胞是否参与了骨髓*性。尽管CAR-NK细胞和受体之间的HLA差异很大，但没有发现移植物抗宿主疾病。虽然CAR-NK细胞的制备中含有一些供体T细胞，但这些细胞的数量显然不足以启动移植物抗宿主疾病的途径。细胞因子释放综合征等CART细胞*性效应在很大程度上是由CART细胞和髓系细胞分泌的IL-6介导的。NK细胞分泌的IL-6比T细胞少。此外，NK细胞和髓系间的相互作用不同于T细胞，炎症细胞因子如白细胞介素-6、肿瘤坏死因子α和干扰素-γ的水平始终稳定在低水平。

综上所述，抗CD19嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法在B细胞癌中显示出显着的临床疗效。然而，CART细胞可诱导明显的*性作用，并且细胞的制造是复杂的。经过修饰以表达抗CD19CAR的自然杀伤（NK）细胞具有克服这些局限性的潜力。例如，针对CD19的CART细胞在68%至93%的急性B淋巴细胞白血病患者中诱导缓解，在57%至71%的慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者中诱导缓解，在64%至86%的非霍奇金淋巴瘤患者中诱导缓解。这些缓解在一定比例的病例中是持久的。

自然杀伤细胞（NKcell）被设计成表达一种CAR，是癌症治疗的候选效应器。来自同种异体来源的自然杀伤细胞，如脐带血，可以安全地给药，而不需要完全的人类白细胞抗原匹配，这消除了为每个患者生产独特的CAR产品的需要。此研究在临床试验中体现了自然杀伤细胞的抗肿瘤潜力，使用逆转录病*载体，该载体表达编码抗CD19CAR、IL-15的基因，以增强转导的自然杀伤细胞的体内扩增和持久性，并在出现不可接受的*性作用时诱导半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9，以触发抗CD19CAR的自然杀伤细胞的凋亡。体现了自然杀伤细胞治疗复发或难治性CD19阳性癌症的安全性和有效性。