前言
乳腺癌是全球女性癌症死亡的主要原因，对乳腺癌生态系统的了解是实施精准医学的基础。单细胞基因组和转录组为乳腺癌的分析提供了肿瘤内基因组多样性和肿瘤间克隆组成差异的见解，但分析的细胞和肿瘤很少。鉴于乳腺癌细胞表型和细胞关系的异质性，患者分类和治疗应考虑整个肿瘤生态系统。
单细胞转录组测序研究为乳腺癌免疫细胞表型多样性和生态系统的进一步探索提供了可能，为探究大型患者队列的研究奠定了基础。因此研究者应用单细胞测序流式细胞仪对来自个人类乳腺肿瘤样本的数百万个细胞进行分析，阐明了乳腺癌生态系统中的表型多样性和肿瘤免疫细胞关系。该单细胞图谱为基于乳腺癌生态系统的患者分类奠定了基础。
由苏黎世大学BerndBodenmiller教授课题组在Cell期刊(IF:66.)发表了题为“ASingle-CellAtlasoftheTumorandImmuneEcosystemofHumanBreastCancer”的研究成果，通过单细胞转录组、单细胞蛋白组，质谱流式等研究技术，描绘了免疫生态系统的单细胞图谱。为肿瘤治疗及其免疫环境的精准医学发展提供了理论依据。
研究思路
研究内容
1.研究材料
个肿瘤样本、46个近肿瘤样本和来自四个缩小乳房成形术的组织的万个细胞
2.研究方法
组织准备：手术切除后，新鲜组织样本立即转移到预冷的MACS组织储存溶液
抗体和抗体标记
抗体染色和细胞体积定量
免疫荧光成像
量化和统计分析
研究结果
1.乳腺癌生态系统的单细胞蛋白质组图谱
研究者对个肿瘤样本进行了大规模单细胞蛋白质组分析，包括54个luminalA，71个luminalB，6个luminalB-HER2，1个HER2，和6个TN肿瘤。组织病理学将样本分为个浸润性导管、15个浸润性小叶和19个混合或其他肿瘤。使用自动化系统从所有组织样本中生成单细胞悬浮液，添加标签后用于抗体染色，并同时通过质谱流式细胞仪进行分析（图1A和S1A）。分析产生了万个单细胞图谱，每个样本平均有84.7%的活细胞、非凋亡细胞（图S1B和S1C)。
为了确保高质量的数据，研究者确认了跨条形码板的重复样本的标记表达以及跨抗体组的活细胞和免疫细胞频率的相似性（图S1D和S1E）。
图S1
乳腺癌单细胞图谱的细胞类型鉴定
为了可视化肿瘤和非肿瘤细胞的多样性，作者使用降维算法t分布随机邻域嵌入生成了二维图。大多数细胞是上皮细胞或免疫细胞，内皮细胞和成纤维细胞的丰度较低（图1B）。额外的成纤维细胞亚群和脂肪细胞可能在被描述为“其他”的细胞中（图1C）。为了比较肿瘤和非肿瘤组织之间的细胞类型频率，作者应用PhenoGraph算法，将数据划分为42个簇（图S1M和S1N）。与非肿瘤组织相比，乳腺肿瘤富含上皮细胞，并且含有更少的内皮细胞和成纤维细胞（图1D）。FAP+SMA+成纤维细胞在肿瘤中比在近肿瘤组织中更丰富（图S1O和S1P）。细胞类型频率在肿瘤亚型之间和之间有所不同，在TN和HER2+样本中观察到的免疫细胞频率高于其他乳腺癌类型（图1E和S1P）。
2.乳腺癌的免疫状况
T细胞和髓细胞是我们研究中最丰富的免疫细胞类型；较少检测到自然杀伤细胞(NK)、B细胞、粒细胞、浆细胞、嗜碱性细胞和浆细胞样树突状细胞(图2A和S2AS2D)。乳腺肿瘤富含T细胞和B细胞，与肿瘤旁组织相比，含有较低频率的NK细胞和粒细胞(图2A)。如前所述，肿瘤相关免疫细胞频率在患者间存在显著差异(图2A)。
图2
乳腺癌的免疫状况
T细胞和巨噬细胞可以发挥促肿瘤或抗肿瘤活性，通过t-SNE和PhenoGraph对T细胞的深入分析确定了十个CD4和十个CD8T细胞簇（T01-T20；图2B-2D）。大多数T细胞簇具有效应记忆表型（CDlow,CD45RAlow），肿瘤相关T细胞作为表型连续体存在于CD4和CD8谱系中（图2D和S2E）。CD4T细胞中PD-1的平均表达水平高于CD8T细胞（图2F）。PD-1的平均表达水平和PD-1T细胞频率在CD4和CD8+隔室中相关，支持这些细胞由T细胞扩增产生的假设。
此外，研究者观察到ER和ER肿瘤的T细胞状况的差异，包括ER疾病中更高频率的T-regs（图2H）。在超过一半的ER肿瘤但只有12%的ER肿瘤中，超过10%的T细胞表达PD-1（图S2G）。不同的PD-1表型分别富集：PD-1highCTLA-4CD38T细胞在ER肿瘤中更常见，而PD-1CTLA-4-CD38-T细胞（T14）在ER+肿瘤中富集（图2H）。然而，许多ER肿瘤确实显示PD-1高CTLA-4CD38T细胞和T-reg的频率与ER肿瘤相当或更高（图2H）。
图S2
乳腺肿瘤和非肿瘤组织中的免疫细胞表型分析
ER肿瘤可根据低增殖和高增殖分别分为luminalA和luminalB。超过10%的T细胞在18%的luminalB肿瘤中表达PD-1，但只有7%的luminalA肿瘤（图S2H）。PD-1intCTLA-4-CD38-T细胞(T07)在luminalA疾病中更常见，而T-regs在luminalB肿瘤中富集（图2I）。作者还在不同级别的肿瘤中观察到不同的T细胞景观。在28%的3级肿瘤、9%的2级肿瘤和10%的1级肿瘤中，PD-1T细胞占T细胞的10%以上（图S2I）。3级肿瘤具有更多的PD-1高CTLA-4CD38T细胞（T09和T11）和更少的PD-1intCTLA-4CD38T细胞（T07和T14）比低级别肿瘤（图S2J）。这表明免疫抑制的T细胞景观与预后不良的肿瘤有关，包括ER、高增殖和高级别肿瘤，但也在一部分ER肿瘤中观察到。
3.乳腺肿瘤富含免疫抑制性巨噬细胞表型
为了表征TAM群体，将t-SNE和PhenoGraph应用于所有骨髓细胞（图2J和S2D），产生五类19个骨髓簇（M01-M19）。与近肿瘤组织相比，肿瘤富含TAM，缺乏组织驻留巨噬细胞（M08和M09）、经典循环（M06）和促炎（M15）单核细胞（图2M）。TAM的浸润与侵袭性疾病有关。
与ER肿瘤相比，ER肿瘤包含更高频率的M01和M17PD-L1TAM，具有M04、M05、M10或M12表型的骨髓细胞更少（图2N）。一部分ER+肿瘤具有M01和M02PD-L1TAM，其频率与ER肿瘤相当或更高（图2N和S2L）。与LuminalA肿瘤相比，LuminalB肿瘤含有更多具有M07或M17表型的髓细胞，较少具有M04表型，以及更多的PD-L1TAM。图2O和S2M)。与2级肿瘤相比，PD-L1TAM在3级肿瘤中富集（图S2N）。与低级别肿瘤相比，3级肿瘤包含更少的具有M04或M05表型的细胞，但更多的经典单核细胞(M06)（图S2O）。
4.肿瘤上皮细胞异质性和表型异常
对来自肿瘤和非肿瘤组织的上皮细胞的分析（STAR方法）揭示了上皮标志物的双峰和梯度样表达，表明许多不同的细胞表型（图3A和3B）。在PhenoGraph中实施的共识聚类方法（图S3A；STAR方法）揭示了45个上皮细胞簇（Ep01-Ep45）。层次聚类根据标记表达将它们分为七个管腔组L1-L7和两个基础组B1和B2（图3C、S3B和S3C）。
图3
乳腺癌肿瘤细胞表型研究
研究者根据谱系标记表达模式鉴定了乳房成形术和近肿瘤组织中的管腔和肌上皮细胞（图3C、3D和S3D）。乳腺上皮细胞系证实了这些模式的可靠性（图3E）。鉴定了增殖的(Ki-67)非肿瘤管腔细胞(图S3E)。大约55%的肿瘤衍生细胞是L1和L2组的成员，这表明肿瘤样本中富含分化的正常样管腔细胞。L3-L7组以肿瘤细胞为主（图3C）。L3组表型显示高水平的EpCAM和CD49f和低ERα表达（图3C和S3D-S3F），这是腔内祖细胞的特征。L4组表型显示出高水平的激素受体ERα、孕酮受体B(PRB)和AR，以及受体酪氨酸激酶HER2、EGFR和肝细胞生长因子受体(c-MET)（图3C和S3F）。这些受体与ERα或HER2的共表达可以赋予抗ERα和抗HER2治疗的抗性。缺乏ERα和HER2与抗ERα和抗HER2治疗的抗性有关。Ki-67luminal肿瘤细胞在所有luminal簇组中均发现，并且在L7组中最常见（图S3G）。
图S3
乳腺肿瘤细胞表型的深入分析
此外，L1-L7组表型在肿瘤亚型中的分布不同。与HER2+和TN肿瘤相比，L1组和L2组表型指示成熟的管腔细胞和L4组和L5组强烈表达ERα的表型在管腔A和B肿瘤中更常见（图3F）。增殖组L7表型常见于几个luminalB肿瘤、几个luminalA肿瘤和一个TN肿瘤。LuminalB-HER2和HER2肿瘤含有来自L3和L6组的细胞（图3F）。与邻近的非肿瘤组织相比，许多管腔肿瘤含有更少的K7和更多的K8和K18细胞（图S3H)，表明可能由上调的PI3K和AKT信号传导诱导的细胞角蛋白转换。
5.表型异常和肿瘤个体性与预后不良的特征
随后，建立了三个计算分数来量化肿瘤异质性的不同方面（图4A）。表型异常描述了肿瘤细胞表型偏离非肿瘤上皮细胞的程度。肿瘤个体性根据细胞表型量化肿瘤的相似性。肿瘤丰富度表示生态系统内不同共存肿瘤细胞表型的数量。
图4
分子表型异常和肿瘤个体性与预后不良的特征
为了描述异常表型，利用自动编码器识别非肿瘤上皮细胞表型并计算每个肿瘤细胞的均方误差(MSE)（图S4A）。结果显示，在上皮簇组L6、L7、B1和B2中检测到最异常的肿瘤细胞（图4B）。与富含来自L1和L2组细胞的肿瘤相比，主要包含来自这些簇的细胞的肿瘤更多地偏离近肿瘤组织（图4C-4E）。表型异常细胞在高级别肿瘤、大多数ER肿瘤、一部分ER肿瘤和预后不良的亚型肿瘤中富集（图4F-4H)。表型异常与缺氧和增殖标志物表达相关（图4I），反映了肿瘤生态系统内的异常生长条件。与4%的CA9肿瘤细胞相比，约25%的CA9肿瘤细胞表现出EMT表型。队列中的一些近肿瘤组织样本包含表型异常细胞和高频率的CA9或Ki-67细胞（图S4B和S4C；表S5），可能代表原位癌前病变导管癌的区域。
图S4
肿瘤和非肿瘤组织样本的表型异常和个体性
为了评估肿瘤生态系统的个体性，对所有样本的上皮细胞数据应用了基于图表的方法（图4A）。个体性得分表明样本的细胞是否更类似于同一样本的细胞或其他样本的细胞（图S4D）。肿瘤显示出比近肿瘤组织更高的个体评分（图4J）。重要的是，肿瘤个体性与表型异常相关（图4K），这表明肿瘤细胞与非肿瘤细胞的表型偏离越多，它们在不同患者的肿瘤中发现的可能性就越小（图S4D)。肿瘤个体性在高级别肿瘤和luminalB、luminalB-HER2或TN亚型肿瘤中更为突出（图S4E）。ER肿瘤的个体差异很大，并且与ERα细胞的百分比相关（图4L和4M）。未检测到个体与侵袭淋巴结或远处转移之间的关联（图S4F）。
为了探索肿瘤丰富度（图4A），计算了每个样本的每个上皮细胞簇的频率，并报告了1%以上的簇数。所有肿瘤和非肿瘤样本都包含来自多个簇的细胞（图4N）。值得注意的是，与非肿瘤组织相比，大多数肿瘤的丰富度没有增加，并且肿瘤丰富度与个体性反相关（图4O和4P）。在43%的肿瘤样本（个中的62个）中，至少50%的肿瘤所有细胞属于一个簇，这可能反映了不同癌细胞克隆的扩增（图4N)。在58%的3级肿瘤、33%的2级肿瘤和35%的1级肿瘤中观察到这种集群优势。在51%的luminalB、50%的luminalB-HER2和67%的TN肿瘤中观察到簇优势，但在luminalA肿瘤中仅占29%。在45个上皮细胞簇中，37个簇（82%）占一个或多个肿瘤中所有细胞的至少50%（图4N）。七个优势簇是肿瘤特异性的，四个显示出高表型异常（图4B和S4G）。
对队列中的10个肿瘤进行的分析，尽管新辅助化疗并未显著消退，但揭示了个体表型组成，表明不同的肿瘤细胞表型在治疗中存活（图4Q）。这些包括具有ERαHER2表型和ERαHER2表型的高度异常肿瘤细胞（图4B和4Q）。从其他四名患者那里收集了同一肿瘤的两个不同区域。在三个案例中，在两个区域都观察到了相似的表型组成。在第四个肿瘤中，优势克隆存在于两个区域，但频率不同，一个区域的增殖特征（5%Ki-67）比另一个区域（0.6%Ki-67）更具增殖性（图S4H）。
6.基于肿瘤生态系统的分类揭示了不同的组和多个肿瘤单例
层次聚类生成的热图显示三组包含许多肿瘤、四组包含三个或四个肿瘤、36个肿瘤单例和三组非肿瘤样本（图5）。主成分分析确定了解释不同组之间最高变异性的集群。此外，Tu1-Tu7组的临床亚型和分级存在异质性（图S5A和S5B）。
图5
肿瘤生态系统中的关系与疾病进展的特征
在N2组中发现了所有乳房成形术样本和54%的近肿瘤样本，表明生态系统密切相关（图5A）。与非肿瘤组织相似，在N2组中发现的五个肿瘤主要包含L1和L2组上皮表型、循环T细胞(T16)和组织驻留巨噬细胞(M08)(图5A)。所有5个肿瘤均为luminalA亚型和低级别，这表明肿瘤在表型上与非肿瘤组织相似，或者这些样本中的肿瘤含量特别低。肿瘤单例通常不共享肿瘤细胞表型，反映了高肿瘤个体性，并且比Tu1和Tu3组的肿瘤具有更高的表型异常评分和更多的增殖细胞（图5C-5E）。LuminalB-HER2、HER2和TN肿瘤要么是小肿瘤组的一部分，要么是单个肿瘤（图5A）。因此，肿瘤上皮及其免疫环境中的模式都包含肿瘤分层信息。
7.乳腺肿瘤及其免疫环境是相互交织的实体，两者对于分类都很重要
肿瘤细胞和肿瘤-宿主细胞相互作用的网络推动着疾病进展，是药物干预有希望的目标。为了系统地阐明同型和异型肿瘤与免疫细胞的关系，对所有样品中所有细胞表型簇的频率进行了成对Spearman相关分析（图6A-6C；表S5）。在来自不同簇组的表型之间发现了同型上皮细胞关系（图6A）。非肿瘤管腔表型如Ep30和Ep31（L1组）是相关的，而肿瘤特异性表型通常分别富集，反映表型优势和肿瘤个体性（图6A）。L1和L2组以及Ep39簇中非肿瘤表型的频率与这些免疫抑制表型呈负相关（图6B），但与PD-1CTLA-4CD38表型T07和T18相关（图6B）。肿瘤相关免疫细胞之间的关系分析显示，T-regs和PD-L1TAM表型与PD-1高CTLA-4CD38的T细胞表型相关，表明免疫抑制相互作用（图6C）。T-regs和PD-L1TAM没有或仅与PD-1CTLA-4CD38T细胞表型负相关（图6C）。
此外，免疫抑制模式与肿瘤表型异常和个体评分、缺氧和增殖相关（图6D）。免疫抑制性TAM和T细胞与ERα细胞丰度之间的相关性（图6D），表明雌激素信号传导是肿瘤生态系统中的塑造力量。
图6
乳腺肿瘤及其免疫环境是相互交织的实体
图S6
肿瘤生态系统中关系的深入分析
关系分析表明肿瘤免疫环境中有相当大的结构，不同亚型的肿瘤，包括ER和ER肿瘤，在TIG2中分组，提出了TIG2中丰富的免疫细胞是否位于肿瘤生态系统近端的问题。因此，除了免疫抑制环境外，TIG2肿瘤生态系统还包含多个肿瘤细胞群，有可能逃避常见的癌症治疗。
相关讨论
异质肿瘤细胞、浸润性T细胞和巨噬细胞之间的交流塑造了乳腺癌生态系统，对疾病进展和临床结果有影响。通过对来自个肿瘤样本、46个近肿瘤样本和来自四个缩小乳房成形术的组织的万个细胞进行大规模细胞计数分析，构建了一个广泛的人类乳腺癌生态系统单细胞图谱。该图谱揭示了乳腺上皮细胞和免疫细胞的巨大表型多样性、肿瘤细胞的表型异常和肿瘤个体性，并突出了同型和异型肿瘤-免疫细胞关系，实现了基于生态系统的患者分类。乳腺癌生态系统图谱的建立为识别肿瘤生态系统中临床相关的细胞表型及其关系提供了基础，为将来用于患者分层和精准医学应用提供了理论依据。
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