弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuselargeB-celllymphoma,DLBCL）是具有侵袭性与高度异质性的恶性淋巴瘤，是最常见的非霍奇金淋巴瘤。根据基因表达谱，DLBCL可被分为活化B细胞样的（activatedBcell-like,ABC）、生发中心B细胞样的（germinalcenterBcell-lie）以及未分类的（unclassified）DLBCL。在经过标准R-CHOP治疗之后，仍有大约40%的难治或复发患者，因此，深入研究DLBCL耐药的分子机制具有重要意义。近年来，靶向蛋白降解嵌合体（proteolysis-targetingchimera,PROTAC）技术的快速发展及其在治疗肿瘤方面的成功应用，展示了靶向蛋白的泛素化与降解通路的治疗潜力。因此，系统地研究E3泛素化连接酶（E3ubiquitinligase）及其底物（substrate）对DLBCL耐药性的调控具有很大价值。
近日，来自美国宾夕法尼亚大学医学院的LucaBusino教授团队在Blood上发表题为DLBCLassociatedNOTCH2mutationsescapeubiquitin-dependentdegradationandpromotechemo-resistance的文章，通过针对CULLIN-RINGE3泛素连接酶文库的CRISPR/Cas9筛选、蛋白组学与转录组学，揭示了E3泛素连接酶KLHL6基因的失活及其底物NOTCH2基因的功能获得性突变（gain-of-functionmutations）促进弥漫大B细胞淋巴瘤耐药的分子机制。
首先，作者构建了具有高效基因编辑能力的DLBCL-Cas9细胞系，用其进行针对CULLIN-RINGE3泛素连接酶文库的CRISPR/Cas9筛选，并用CHOP中的关键组分doxorubicin来处理细胞，作者发现在药物处理组，有17个基因的sgRNA被富集，其中KLHL6基因在DLBCL中有较多的功能缺失性突变（loss-of-functionmutation），因此，作者聚焦于研究KLHL6的失活调控DLBCL耐药的分子机制。作者构建了敲除了KLHL6的两个ABC-DLBCL和两个GCB-DLBCL细胞系，体外细胞培养试验显示敲除了KLHL6的细胞对药物的敏感性降低；肿瘤异种移植试验（tumorxenotransplantation）显示相比于对照组，敲除了KLHL6的肿瘤在经过CHOP处理后更早地复发。
接下来作者通过蛋白组学研究，鉴定了跨膜的NOTCH2是KLHL6的底物。为了验证跨膜的NOTCH2是KLHL6的底物，作者在敲除了KLHL6的两个ABC-DLBCL和两个GCB-DLBCL的细胞系中发现了KLHL6的敲除导致了跨膜的NOTCH2蛋白水平显著上调，而对于NOTCH2前体没有影响。环己酰亚胺追踪试验（cycloheximidechaseassay）显示KLHL6的敲除导致了跨膜的NOTCH2的半衰期显著增加。为了进一步验证细胞膜上的NOTCH2是KLHL6的底物，作者使用了NOTCH2的荧光抗体和流式细胞仪来进行分析，发现KLHL6的敲除造成了细胞膜的NOTCH2的蛋白水平明显上调。
既然跨膜的NOTCH2是KLHL6的底物，那么KLHL6的缺失所造成的耐药性是否依赖于跨膜的NOTCH2呢？为了研究这个问题，作者构建了KLHL6与NOTCH2的单基因敲除以及双基因敲除的细胞系，并进行了肿瘤异种移植试验，结果表明KLHL6缺失的肿瘤更早复发的表型被NOTCH2的缺失所逆转。转录组测序以及基因集富集分析（GeneSetEnrichmentAnalysis,GSEA）显示与对照组相比，KLHL6缺失的肿瘤中MYC激活的靶基因存在显著性富集，但这一调控被NOTCH2的缺失所逆转。
在DLBCL患者中，NOTCH2存在频率较高的突变，而且绝大多数突变位于NOTCH2蛋白的C端结构域，其中包含有导致NOTCH2蛋白被截短的无义突变（nonsensemutation），接下来的问题是，NOTCH2的无义突变是否会通过丢失KLHL6降解子（degron）从而增加其蛋白稳定性呢？为了研究这个问题，作者通过免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,co-IP）方法发现KLHL6结合在NOTCH2的C端结构域，且该结合位点不同于之前已报道的E3泛素连接酶FBXW7在NOTCH2上的结合位点。作者通过构建稳定表达DLBCL相关的NOTCH2突变体的细胞系，发现了与野生型NOTCH2相比，缺失了FBXW7降解子的跨膜NOTCH2突变体（R*）的蛋白稳定性有所增加，而同时缺失了KLHL6和FBXW7降解子的跨膜NOTCH2突变体（Q*）的蛋白稳定性显著增加。为了进一步研究NOTCH2突变体的功能，作者进行了肿瘤异种移植试验，结果显示表达跨膜NOTCH2突变体（Q*）的肿瘤最早复发，其次是表达跨膜NOTCH2突变体（R*）的肿瘤。转录组测序以及GSEA显示与对照组相比，表达跨膜NOTCH2突变体（Q*）的肿瘤中KRAS激活的基因与P53抑制的基因存在显著性富集。作者进一步通过染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）揭示了NOTCH2突变体（Q*）可以促进更多的转录因子RBP-J结合在KRAS等基因的启动子区域并增强其转录。
为了研究KLHL6和NOTCH2突变的临床相关性，作者通过文献检索以及对数据库的分析，发现与经过R-CHOP治疗后完全缓解的患者相比，药物治疗早期失败的患者中富集了KLHL6和NOTCH2的突变；而携带有同时缺失KLHL6和FBXW7降解子的NOTCH2突变的患者生存时间显著地少于携带野生型NOTCH2的患者。为了寻找新的治疗手段，作者对-分泌酶的抑制剂与MAPK信号通路的抑制剂进行了筛选，并用肿瘤异种移植试验证明了已经处于临床3期的-分泌酶抑制剂nirogacestat与AKT抑制剂ipatasertib的联用能够有效抑制对CHOP耐药的DLBCL的肿瘤生长。
综上所述，该研究工作鉴定了NOTCH2的一个新颖的E3泛素连接酶KLHL6，并揭示了KLHL6的功能缺失性突变与NOTCH2的功能获得性突变促进弥漫大B细胞淋巴瘤耐药的分子机制，并启发了将-分泌酶抑制剂nirogacestat与AKT抑制剂ipatasertib联用的新的治疗手段。
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